一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條制造技術(shù)

本實用新型專利技術(shù)涉及一種快速鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條，含有支撐層和吸附層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有檢測印跡和對照印跡，金標(biāo)抗體纖維層上吸附有膠體金標(biāo)記的葡萄球菌蛋白A，檢測印跡用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原中的一種或兩種印制，對照跡用羊或兔抗SPA的IgG抗體溶液印制。本實用新型專利技術(shù)的試紙條特異性強，靈敏度高，簡便，直觀，準(zhǔn)確，適用范圍廣，成本低，專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時隨地實時檢測，易于推廣應(yīng)用。（*該技術(shù)在2022年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條
[0001 ] 本技術(shù)涉及一種檢測口蹄疫病毒的器具，特別是涉及一種快速鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條。
技術(shù)介紹
口蹄疫(Foot-and-mouth_disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄動物的一種烈性傳染性疫病。FMDV具有多型性、易變性、宿主廣泛性、傳染力極強等特點，一旦發(fā)病即呈流行性、大爆發(fā)性。FMD的爆發(fā)和流行常給發(fā)病地區(qū)造成巨大損失，除動物死亡造成的直接經(jīng)濟損失外，還有動物患病期間肉和奶的生產(chǎn)停滯、病愈后肉和奶的產(chǎn)量長期下降以及種用價值喪失等較大損失。更為嚴(yán)重的是，F(xiàn)MD是一種烈性傳染病，具有極強的傳染性，對于發(fā)病動物以及接觸病原的同群動物，必需進(jìn)行嚴(yán)格隔離、封鎖、禁止動物移動和畜產(chǎn)品上市等。因此，F(xiàn)MD導(dǎo)致發(fā)病地區(qū)甚至發(fā)病國家的畜產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易停止，除造成巨大的經(jīng)濟損失外，還產(chǎn)生一定的政治影響。疫苗接種是發(fā)展中國家控制FMD的主要策略，由于FMD固有的特點，目前國內(nèi)外的疫苗只能保護(hù)免疫動物不發(fā)生FMD，但是這種方法不能防止免疫動物再次發(fā)生FMDV的感染。在疫區(qū)的免疫動物群中，有一定數(shù)量的動物是病毒攜帶者，這些動物有可能持續(xù)向外排毒，在牛、羊體內(nèi)形成持續(xù)性感染的病毒可長期存在。這些隱性感染或帶毒的動物不但可能引發(fā)新的疫情，還為病毒變異和產(chǎn)生新毒株提供了環(huán)境。因此，F(xiàn)MDV疫苗免疫動物抗體水平以及如何區(qū)分免疫動物和病毒感染動物是控制FMDV的關(guān)鍵問題。目前使用的FMDV疫苗主要是滅活疫苗和合成肽疫苗。滅活疫苗免疫動物后，動物體內(nèi)不會有病毒增殖，疫苗生產(chǎn)中在病毒純化過程中已經(jīng)去除了絕大部分的非結(jié)構(gòu)蛋白 (NSP)，沒有了非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，因而在免疫動物體內(nèi)就不會有非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的產(chǎn)生， 多肽疫苗本身就是FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VPl上的一個主要抗原表位，更沒有非結(jié)構(gòu)蛋白的存在。 而FMDV感染的動物體內(nèi)，在病毒裝配過程中有大量非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的非機構(gòu)蛋白抗體。結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測可以監(jiān)控動物的免疫狀態(tài)和抗體產(chǎn)生水平，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測技術(shù)為區(qū)分感染動物和免疫動物提供依據(jù)，結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白檢測技術(shù)的結(jié)合可以達(dá)到一步檢測FMDV免疫抗體水平以及區(qū)分FMDV感染動物和疫苗免疫動物的目的。目前實驗室檢測FMDV抗體的方法有(I)病毒分離從患病動物的病料中分離出病毒，再對分離到的病毒進(jìn)行培養(yǎng)鑒定做出診斷，確定是否FMDV感染。這種技術(shù)準(zhǔn)確可靠， 但敏感性差，而且有些樣品中存在補體活性，影響檢測效果，并且需要專門的實驗室。(2)病毒中和試驗利用病毒與特異性血清中和抗體的相互作用，從而使病毒失去對易感動物和敏感細(xì)胞的感染能力，這一方法必須使用活病毒，普通實驗室不能操作。(3)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA):主要有區(qū)分感染與免疫的非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA (I-ELISA)和檢測疫苗免疫動物的血清抗體水平的液相阻斷ELISA。ELISA方法測定時具有特異、敏感等優(yōu)勢，但操作復(fù)雜、費時、費力，需要特定的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，很難在基層普及推廣。同時，液相阻斷ELISA方法需要滅活病毒的參與，因此，還存在病毒滅活不全或病毒逃逸等風(fēng)險。此外， 近年來隨著豬O型FMD合成肽疫苗的推廣應(yīng)用，已經(jīng)逐步占據(jù)了主要市場，傳統(tǒng)的液相阻斷 ELISA很難對多肽疫苗抗體做出準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。因此，研究一種簡便快速、一步可以檢測疫苗免疫和病毒感染的實時在線檢測技術(shù)，非常重要而迫切。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本技術(shù)要解決的技術(shù)問題克服現(xiàn)有技術(shù)中檢測口蹄疫病毒抗體和疫苗抗體存在的缺陷，提供一種特異性強、敏感性高、簡便、快速鑒別口蹄疫病毒抗體和疫苗抗體的免疫金標(biāo)試紙條。本技術(shù)的技術(shù)方案一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條，含有支撐層和吸附層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有檢測印跡和對照印跡，所述金標(biāo)抗體纖維層上吸附有膠體金標(biāo)記的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述檢測印跡用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原中的一種或兩種印制，對照印跡用羊或兔抗SPA的IgG抗體印制。所述支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑膠條或硬紙條制成；樣品吸附纖維層用玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成；金標(biāo)抗體纖維層用玻璃棉制成。所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、纖維素膜、羧甲基纖維素膜或聚偏二氟乙烯 PVDF纖維素膜制成；所述吸水材料層用吸水紙制成。所述纖維素膜層上含有一條/個檢測印跡時，檢測印跡、對照印跡的排列形式為 “ I I ”、“十十，，、“丁丁，，、“丄丄，，、“ I- ρ，、“~| H，，和“籲 ”中的任一種；纖維素膜層上含有兩條/個檢測印跡時，檢測印跡、對照印跡的排列形式為“ I I I ”、“十十十”、“I I 丁”、“丄丄丄，，、“ [_，，、“_! ” 和“# # 籲”中的任一種。在所述樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護(hù)膜，在樣品吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線。本技術(shù)的積極有益效果I、檢測特異性強、敏感性高本技術(shù)試紙條以膠體金標(biāo)記的SPA為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)SPA中的金顆粒與抗原或SPA分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金對大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原的特異性影響很小，也不影響SPA與抗體的結(jié)合及抗體與抗原的結(jié)合，且具有較高的標(biāo)記率。因此，本技術(shù)的試紙條具有較高的特異性和敏感性，可檢測到2納克的相應(yīng)抗體蛋白。2、操作簡便、快速本技術(shù)的試紙條檢測過程中無需附加其它儀器和試劑，只要將其測試端插入待檢血清中30秒左右，等5分鐘左右即可判定檢測結(jié)果。3、結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確試紙條以顯示棕紅色的檢測印跡和對照印跡作為檢測的陽性和陰性標(biāo)記，即在纖維素膜層上只顯示一條棕紅色對照印跡C，表示在被檢血清中既無 FMDV感染抗體也無FMDV疫苗免疫抗體，即被檢動物無FMDV感染也無FMDV免疫或免疫不合格；若在纖維素膜層上顯示一條棕紅色對照印跡C和兩條棕紅色檢測印跡P、J，則表示被4檢動物有FMDV感染；若在纖維素膜層上顯示一條棕紅色對照印跡C和一條棕紅色檢測印跡 P，則表示在被檢血清中含有FMDV疫苗免疫抗體；結(jié)果判定直觀、準(zhǔn)確、簡單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽性的誤判。4、生產(chǎn)系統(tǒng)可靠本技術(shù)中的檢測印跡采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為生產(chǎn)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)的研究較為深入，已經(jīng)過反復(fù)驗證，作為生產(chǎn)系統(tǒng)時培養(yǎng)條件簡單、基因操作容易，從構(gòu)建到產(chǎn)物純化周期較短，成本低，產(chǎn)量高，適合于工業(yè)化應(yīng)用。5、投資少，成本低使用本技術(shù)試紙條不需要另配其它儀器、設(shè)備和試劑，節(jié)省大量儀器、設(shè)備和附加試劑費用；一條試紙條一次可以檢測一種或兩種抗體，專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時隨地進(jìn)行實時在線檢測，無需支付專家診斷費及相關(guān)費用，可節(jié)省檢測成本，降低檢測費用。6、應(yīng)用范圍廣，便于推廣本技術(shù)的試紙條操作簡單成“一步式”、“傻瓜式”， 而且方便攜帶和保存，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測、畜產(chǎn)品本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條，含有支撐層和吸附層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有檢測印跡和對照印跡，其特征是：所述金標(biāo)抗體纖維層上吸附有膠體金標(biāo)記的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述檢測印跡用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原中的一種或兩種印制，對照印跡用羊或兔抗SPA的IgG抗體印制。

【技術(shù)特征摘要】
1.一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條，含有支撐層和吸附層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有檢測印跡和對照印跡，其特征是所述金標(biāo)抗體纖維層上吸附有膠體金標(biāo)記的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述檢測印跡用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原中的一種或兩種印制，對照印跡用羊或兔抗SPA的IgG抗體印制。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征是所述支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑膠條或硬紙條制成；樣品吸附纖維層用玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成；金標(biāo)抗體纖維層用玻璃棉制成。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征是所述纖維素膜層用硝酸...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張改平，楊蘇珍，盧清俠，職愛民，楊繼飛，喬松林，鄧瑞廣，
申請(專利權(quán))人：河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，
類型：實用新型
國別省市：