本發明專利技術提出了一種誘導葉柄愈傷組織形成多倍體英國梧桐的方法，是通過秋水仙素誘導葉柄愈傷組織加倍形成多倍體英國梧桐新品種（系），以用于解決英國梧桐的“飛毛”問題。其步驟為：a)英國梧桐優株種子的無菌萌發，b)無菌苗葉柄愈傷組織誘導，c)葉柄愈傷組織的秋水仙素處理，d)處理后愈傷組織的恢復培養，e)愈傷組織分化出苗，f)芽苗分化出根，g)組培植株的移植，h)成活植株后的觀察和選擇，i)選株的無性擴繁成穩定品種（系）。本發明專利技術的多倍體英國梧桐新品種，有利于產生少種子或無種子的球果，免除了飛毛的產生，減少了城市污染，美化了城市環境。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種多倍體英國梧桐品種選育方法，特別是，屬于現代農業的樹木育種
技術介紹
懸鈴木科(Platanaceae)植物僅含懸鈴木屬I屬。在我國引進三個物種栽培，即一球的美國梧桐(/Vaiazw1S occidentalis Linn. )，二球的英國梧桐(Platanusacceri folia (kit.) Willd)和三球的法國梧桐 ipiatanus orientalis Linn.),其中以二球的英國梧桐最多.其樹形高大、雄偉端莊、枝葉繁茂、耐修剪、易繁殖、生長快、壽命長、抗 煙塵和空氣污染，是優秀的庭院樹和行道樹種鄭萬鈞.中國樹木志.1985:1923-1926;陳有民主編.園林樹木學.1990:400-403。但是在武漢4月一 5月份球果干枯炸裂，其種子 上的冠毛隨處飛舞，不僅污染環境，且經常吹入人口和人眼，導致人們的皮膚疼癢、咳嗽等不適及眼角膜炎等疾病。為此，解決懸鈴木飛毛問題是一個極其困難，又必須解決的問題。解決懸鈴木飛毛問題的生物技術途徑有兩條。一是利用多倍體化后植株結實率明顯降低，而四倍體與二倍體雜交形成的三倍體就像無籽西瓜那樣完全不結實，從而解決飛毛問題;二是利用花器形成或減數分裂基因的失活去產生無花器或完全不育而不能形成種子的不產生飛毛的突變系，從而解決飛毛問題。
技術實現思路
本專利技術的目的是提出，是通過秋水仙素誘導葉柄愈傷組織加倍形成多倍體英國梧桐新品種(系)，以用于解決英國梧桐的“飛毛”問題。本專利技術的技術方案為a.英國梧桐優株種子的無菌萌發；b.無菌苗葉柄愈傷組織誘導；c.葉柄愈傷組織的秋水仙素處理；d.處理后愈傷組織的恢復培養；e.愈傷組織分化出芽苗；f.芽苗分化出根；g.組培植株的移植；h.成活植株的比較觀察與選擇；1.選株的無性擴繁成穩定品種(系)。本專利技術的具體過程為a.英國梧桐優株種子的無菌萌發選擇生長旺盛、無病蟲害的優良英國梧桐單株上所結的果球，從中剝取種子為研究材料，種子經過O. 1%升萊處理16min—20min后,用無菌水沖洗三遍。將種子接種在萌發培養基上，每IOOml三角瓶接種15粒種子，在25°C黑暗或15001x光照12hr/d下萌發。接種7天一 15天后種子萌發出苗；所述萌發培養基配方為1/2MS大量元素+MS的有機成分+MS的微量元素+MS的鐵鹽+0. lmg/L—O. 3mg/L6BA+4% 蔗糖 +0. 75% 瓊脂，ρΗ5· 8 ；b.無菌苗葉柄愈傷組織誘導當無菌苗生長3個一5個葉片時，在無菌超凈工作臺上剪下完整葉片，保留O. 5cm—O.8cm葉柄和葉柄上1/5的葉片。再將剪好的葉片的葉柄直立插入到葉柄愈傷組織誘導培養基中，每IOOml三角瓶接種10個處理的帶柄葉片。置于20001X光照10hr/d，25°C條件下培養。15天一25天在葉柄基部出現黃色緊實的圓球形愈傷組織；所述葉柄愈傷組織誘導培養基配方為MS +1. Omg/L 2. Omg/L 6BA +1. Omg/L 2. 5mg/L NAA+ 4% sucrose + 0. 75% agar, pH5.8 ；c.葉柄愈傷組織的秋水仙素處理當葉柄愈傷組織生長到35天一40天時，將帶愈傷組織的葉柄取出，在超凈工作臺上去除葉柄和殘留葉片，將愈傷組織置于添加500mg/L 750ml/L秋水仙素，但不加瓊脂的葉柄愈傷組織誘導培養基的葉柄愈傷組織加倍培養基中，放在溫室(25°C )搖床上，在50轉飛O轉/分鐘的速度下旋轉培養48hr 60hr ；所述加倍培養基配方為MS+500mg/L 750mg/L秋水仙素+1. 0mg/L 2. 0mg/L 6BA+1. 0mg/L 2. 5mg/L NAA+4% sucrose , pH5. 8 ； d.處理后愈傷組織的恢復培養葉柄愈傷組織加倍處理完畢，取出愈傷組織經無菌水沖洗三次和無菌濾紙吸干愈傷組織表面水分后，再將其接種到葉柄愈傷組織誘導培養基上，恢復培養7天。e.愈傷組織分化出芽苗經恢復培養的愈傷組織接種到分化培養基中分化培養。15天 20天后愈傷組織呈現綠點，25天 45天后陸續分化出芽苗，并可見叢苗出現；所述分化培養基配方為MS+1. 5mg/L 3. 0mg/L 6BA+3% sucrose+0. 75% agar pH5. 8 ；f.芽苗分化出根當芽苗分化生長到2. Ocm-8. Ocm時，將芽苗靠近愈傷組織處剪斷移植于生根培養基中，20天 25天后芽苗基部分化出根而形成完整的組織培養植株；所述生根培養基配方為1/2MS+0. lmg/ L ^l. Omg/ L IBA+2% sucrose+0. 75% agar,pH5.8 ；g.組培植株的移植當組培植株生長到8. 0cnTl2. Ocm高，具有I個 3個根的時候，將進行組培植株的移植。首先將要移植植株的培養瓶蓋打開，每瓶添加IOmf 15ml無菌水，放到常溫的實驗室內緩苗2天，然后充分清洗掉植株根部的培養基，將植株移栽到滅菌的70%蛭石+15%細砂+15%園土的基質中，澆上1/10MS大量元素溶液，蓋上薄膜和黑網(50%遮光率)。然后每2天噴灑1/10MS大量元素溶液，直至植株成活，再逐步揭開黑網和薄膜，使組培苗健壯生長；h.成活植株的比較觀察與選擇根據多倍體和二倍體植株外部形態的差異，選取葉片變厚，葉色變濃的植株為初選多倍體株，再取候選多倍體株的葉片表皮細胞觀察氣孔密度和氣孔保衛細胞內的葉綠體數。多倍體植株氣孔密度變小，氣孔變大，保衛細胞內的葉綠體數目接近二倍體英國梧桐的二倍；再將多倍體葉片和二倍體葉片的細胞核進行細胞流式分析儀的DNA含量測定，多倍體材料葉片中DNA含量相對為二倍體DNA量的二倍。經過形態特征，氣孔觀察和DNA含量測定都明顯顯示出多倍體特點的植株確定為多倍體英國梧桐單株(本專利技術所指的多倍體英國梧桐單株是四倍體)。1.選株經無性擴繁成穩定品種(系)由于英國梧桐可以靠枝條莖段繁殖，因此讓已確定為多倍體英國梧桐的單株生長到SOcm-1OOcm時截取枝條，按每莖段含3個芽作為繁殖莖段，于立春后的2天-20天內插植于苗床上進行無性擴繁，而成為穩定的多倍體英國梧桐品種(系)。經上述步驟選育的多倍體英國梧桐品種(系)具有幾種優良效果1.經過優株上的種子無菌萌發后的無菌苗所取材料不易污染，而且條件易控制，能保證取材的一致性和無菌性操作。2.葉柄愈傷組織誘導頻率高，而且能夠在培養基中生長，吸收營養快，生長速度快。3.用葉柄愈傷組織進行染色體加倍，誘導效果比整體小苗處理效果好，而且再分化出苗后產生嵌合體的頻率低。4.通過對選擇多倍體單株的莖段無性擴繁，能較快地形成穩定的多倍體英國梧·桐品種(系)而應用于生產。本專利技術的多倍體英國梧桐新品系，將產生少生種子會不生種子的球果，免除了飛毛的產生，減少了城市污染，美化了城市環境。附圖說明圖1為本專利技術無菌苗葉柄愈傷組織誘導的帶柄葉片圖片，圖2為本專利技術20天后的圓球形愈傷組織圖片，圖3為本專利技術愈傷組織分化出芽苗圖片，圖4為本專利技術芽苗分化出根圖片，圖5為本專利技術組培植株的移植生長圖片，圖6為本專利技術多倍體英國梧桐單株移植苗床上圖片。具體實驗方式下面以實施例一多倍體英桐11號的選育對本專利技術進一步說明a.英國梧桐優株種子的無菌萌發本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種誘導葉柄愈傷組織形成多倍體英國梧桐的方法，其特征在于選育過程為：a.英國梧桐優株種子的無菌萌發選擇優良英國梧桐單株的種子經過0.1%升汞消毒處理16min—20min后，接種在萌發培養基上，在25℃黑暗或1500lx光照12hr/d下萌發，接種7天—15天后種子萌發出苗；所述萌發培養基配方為：1/2MS大量元素+MS的有機成分+MS的微量元素+MS的鐵鹽+0.1mg/L—0.3mg/L6BA+4%蔗糖+0.75%瓊脂，pH5.8；b.無菌苗葉柄愈傷組織誘導當無菌苗生長3個—5個葉片時，在超凈工作臺上剪下完整葉片，保留0.5cm—0.8cm葉柄和葉柄上1/5的葉片，再將剪好的葉片的葉柄直立插入到葉柄愈傷組織誘導培養基中，置于20001X光照10hr/d，25℃條件下培養，15天—25天在葉柄基部出現黃色緊實的圓球形愈傷組織；所述誘導培養基配方為MS+1.0?mg/L~2.0mg/L?6BA+1.0?~2.5mg/L?NAA+4%??Sucrose+0.75%瓊脂?，pH5.8；c．葉柄愈傷組織的秋水仙素處理當葉柄愈傷組織生長到35天—40天時，將愈傷組織置于添加500mg/L~750ml/L秋水仙素，但不加瓊脂的葉柄愈傷組織加倍培養基中，放在溫室（25℃）搖床上，在50轉~60轉/分鐘的速度下旋轉培養48hr~60hr；所述加倍培養基配方為：MS+500mg/L~750mg/L秋水仙素+1.0mg/L~2.0mg/L?6BA+1.0mg/L~2.5mg/LNAA+4%?Sucrose?，pH5.8；d．處理后愈傷組織的恢復培養葉柄愈傷組織加倍處理完畢，取出愈傷組織經無菌水沖洗和吸干表面水分后，接種到葉柄愈傷組織誘導培養基上，恢復培養7天；e．愈傷組織分化出芽苗經恢復培養的愈傷組織接種到分化培養基中分化培養15天~20天后愈傷組織呈現綠點，25天~45天后陸續分化出芽苗，并可見叢苗出現；所述分化培養基配方為：MS+1.5mg/L~3.0mg/L?6BA+3%?Sucrose+0.75%?agar，?pH5.8；f．芽苗分化出根當芽苗分化生長到2.0cm—8.0cm時，將芽苗靠近愈傷組織處剪斷移植于生根培養基中，20天~25天后芽苗基部分化出根而形成完整的組織培養植株；所述生根培養基配方為：1/2MS+0.1mg/?L?~1.0mg/?L?IBA+2%?sucrose+0.75%?agar，pH5.8；g．組培植株的移植當組培植株生長到8.0cm~12.0cm高，具有1個~3個根的時候，將進行組培植株的移植，首先將要移植植株的培養瓶蓋打開，每瓶添加10ml~15ml無菌水，放到常溫的實驗室內緩苗2天，然后充分清洗掉植株根部的培養基，將植株移栽到滅菌的70%蛭石+15%細砂+15%園土的基質中，澆上1/10MS大量元素溶液，蓋上薄膜和黑網，然后每2天噴灑1/10MS大量元素溶液，直至植株成活，再逐步揭開黑網和薄膜，使組培苗健壯生長；h．成活植株的比較觀察與選擇根據多倍體和二倍體植株外部形態的差異，選取葉片變厚，葉色變濃的植株為初選多倍體株，再取候選多倍體株的葉片表皮細胞觀察氣孔密度和氣孔保衛細胞內的葉綠體數多倍體植株氣孔密度變小，氣孔變大，保衛細胞內的葉綠體數目接近二倍體英國梧桐的二倍；再將多倍體葉片和二倍體葉片的細胞核進行細胞流式分析儀的DNA含量測定，多倍體材料葉片中DNA含量相對為二倍體DNA量的二倍；經過形態特征，氣孔觀察和DNA含量測定都明確顯示出多倍體特點的植株確定為多倍體英國梧桐單株；i.選株經無性擴繁成穩定品種、品系將已確定為多倍體英國梧桐的單株生長到80cm?100cm時截取枝條，按每莖段含3個芽作為繁殖莖段，于立春后的2天?20天內插植于苗床上進行無性擴繁，而成為穩定的多倍體英國梧桐品種（系）。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡得田，陳冬玲，王維，宋兆建，何玉池，
申請(專利權)人：湖北大學，
類型：發明
國別省市：
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