本發明專利技術公開了一種Thermus脂肪酶的固定化方法：將氨基化納米磁性載體Fe3O4/SiO2與pH8.0的緩沖溶液混合，加入質量濃度25%的戊二醛水溶液，室溫下磁力攪拌4h，再加入以所述Tris-HCl緩沖溶液溶解的Thermus脂肪酶（Thermus?thermophilus?WL）的緩沖溶液，室溫下磁力攪拌3.5h，磁分離，棄去上清液a，將沉淀a用緩沖溶液洗滌，冷凍干燥，獲得固定化的Thermus脂肪酶；本發明專利技術所述固定化Thermus脂肪酶耐熱范圍40-100℃，pH值適應范圍4.0-9.0，對金屬離子，酶抑制劑及去污劑有較強的耐受性；具有極好的超順磁性，易磁分離回收，較好的操作穩定性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種脂肪酶的固定化方法，特別涉及。
技術介紹
脂肪酶(lipase，EC3.1.1. 3)是一類特殊的酰基水解酶，能夠在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交換、內酯合成、多肽合成、高聚物合成及立體異構體拆分等化學反應。 迄今為止已分離提純了來源于動植物和微生物的各種脂肪酶，目前被廣泛研究的一種酶催化劑，被廣泛地應用于洗滌劑、油脂與食品加工、有機合成、表面清洗、醫藥、化妝品、香料、 皮革與造紙工業、生物柴油的制備、油脂改性等方面的研究。Thermus脂肪酶是從深海熱液口等高溫環境中的嗜熱微生物(>55°C )中分離得到的一類嗜熱性脂肪酶，具有常規中溫酶(20°C飛5°C )及低溫酶(<20°C )無法比擬的優點， 由于嗜熱酶的高溫反應活性，以及對有機溶劑、去污劑和變性劑的較強抗性，使它在食品、 醫藥、制革、石油開采及生物柴油等方面都有廣泛的應用潛力。但由于酶的價格昂貴、難以回收且在反應過程中易失活等原因，很大程度上限制了它在工業化生產中的應用。所謂酶的固定化，就是用固體材料將酶束縛或限制于一定區域內，仍能進行其特有的催化反應、并可回收及重復利用的一類技術。酶通過固定化后可以提高活力和穩定性，而且易于回收重復使用，因此酶固定化技術被廣泛地應用，以降低生產成本、提高生產效率。
技術實現思路
本專利技術目的是提供，為熱穩定嗜熱酶類 (Mn-SOD)的固定化和應用提供一 種新的策略。本專利技術采用的技術方案是，所述方法為將氨基化納米磁性載體Fe3O4/ SiO2與pH8. O的緩沖溶液混合，加入質量濃度25%的戊二醛水溶液，室溫下磁力攪拌4h， 再加入以所述Tris-HCl緩沖溶液溶解的Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的緩沖溶液，室溫下磁力攪拌3. 5h，磁分離，棄去上清液a，將沉淀a用緩沖溶液洗滌，冷凍干燥，獲得固定化的Thermus脂肪酶；所述Thermus脂肪酶按下述方法獲得將序列號為 AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因以大腸埃希氏桿菌(優選E. Coli BL21(DE3))為宿主細胞進行重組，獲得含有Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏桿菌CGMCC NO :1. 12252 ;將含有 Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏桿菌CGMCC NO :1. 12252的單菌落接種于LB液體培養基中，37°C、250rpm培養4h，獲得培養液a，取培養液a以體積分數1%的接種量接種于新鮮 LB液體培養基中，37°C、250rpm培養3h，獲得培養液b，在培養液b中加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為O. 5mM, 37°C下培養4h，離心，將沉淀b加入pH7. 9的BufferA 緩沖液中，在IOKHz頻率下進行超聲裂解，離心，取上清液b進行Ni柱親和層析，洗脫液經孔徑7KDa的透析膜透析(MWC07kDa，ThermoSCIENTIFIC)后，取截留液冷凍干燥，獲得所述Thermus脂肪酶。進一步，所述氨基化納米磁性載體Fe304/Si02按如下方法制備(1)將氯化鐵和氯化亞鐵以物質的量之比3:2混合后，加水配制成混合液，在氮氣氛圍中，將混合液在30°C 下攪拌5min后，分別依次逐滴滴加質量濃度25%的氨水溶液a和聚乙二醇，滴加完畢后， 在60°C條件下繼續通入氮氣反應30min后，將反應液在53KHz下超聲分散5min，室溫下自然冷卻至25°C后進行磁分離，取沉淀c用超純水洗滌至中性后干燥，獲得Fe3O4納米顆粒； 所述水的體積用量以氯化鐵和氯化亞鐵中鐵的總物質的量計為4600ml/mol ;所述氨水溶液a的體積用量以氯化鐵和氯化亞鐵中鐵的總物質的量計為400ml/mol，所述聚乙二醇的體積用量以氯化鐵和氯化亞鐵中鐵的總物質的量計為200ml/mol ;所述聚乙二醇的分子量為4000 ; (2)將Fe3O4納米顆粒與無水乙醇、水和質量濃度25%的氨水溶液b混合，在53KHz 下進行超聲分散lh，然后在室溫下攪拌，同時緩慢滴加正硅酸乙酯，滴加完畢后室溫反應 12h，反應完畢后，將反應液進行磁分離，沉淀d用蒸餾水洗滌至中性，再將洗滌后的沉淀 d在lmol/L的鹽酸中室溫浸泡12h，磁分離，去除鹽酸后將沉淀e水洗至中性，干燥，獲得 Fe304/Si02復合顆粒；所述無水乙醇、水的體積用量以Fe3O4納米顆粒質量計分別為80ml/g、 20ml/g，所述的氨水溶液b體積用量以Fe3O4納米顆粒質量及為2. 5ml/g ;所述正硅酸乙酯的體積用量以Fe3O4納米顆粒質量計為1. 5ml/g ; (3)將Fe304/Si02復合顆粒加入無水乙醇中，在53KHz下超聲分散Ih后，加入質量濃度25%的氨水溶液c繼續在53KHz下超聲分散 lOmin，然后通入氮氣保護，在攪拌的條件下滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷，同時在50°C反應 8h，反應結束后將反應液在室溫下自然冷卻至25°C，磁分離，沉淀用蒸餾水洗滌至中性，再用無水乙醇洗滌后干燥，獲得所述氨基化納米磁性載體Fe304/Si02 ;所述Fe304/Si02復合顆粒與無水乙醇、氨水溶液c和3-氨丙基三乙氧基硅烷的質量體積比分別為1:60、1 :6、1 :4。進一步,所述氨基化納米磁性載體Fe304/Si02與pH8. O的緩沖溶液混合配制成載體終濃度10mg/mL的混合液。進一步，所述戊二醛水溶液的體積用量以氨基化納米磁性載體Fe304/Si02質量計為 19.05ml/g。進一步，所述Thermus脂肪酶與氨基化納米磁性載體Fe304/Si02的質量比為 O. 0925 lo更進一步，所述的Thermus脂肪酶的固定化方法推薦按如下步驟進行將氨基化納米磁性載體Fe304/Si02與pH8. O的Tris-HCl緩沖溶液混合制成載體終濃度10mg/mL的混合液，再加入質量濃度25%的戊二醛水溶液，室溫下磁力攪拌4h，然后加入Thermus脂肪酶的Tris-HCl緩沖溶液，室溫下磁力攪拌3. 5h，磁分離，棄去反應液，將沉淀用pH8. O的 Tris-HCl緩沖溶液洗滌，冷凍干燥，獲得所述固定化的Thermus脂肪酶；所述戊二醛水溶液的體積用量以氨基化納米磁性載體？6304/5;102質量計為19. 05ml/g ;所述Thermus脂肪酶與氨基化納米磁性載體Fe304/Si02的質量比為O. 0925 :1。本專利技術所述將序列號為AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因(保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)以大腸桿菌E. ColiBL21 (DE3)為宿主細胞進行重組，獲得含有Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏桿菌，并于2012年6月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號CGMCC NO,1. 12252，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所。本專利技術所述的沉淀沉淀e均為沉淀，為便于區分不同步驟獲得的沉淀不同而命名，所述培養液a和培養液b均為培養液，為便于區分不同步驟獲得培養液不同而命名，所述氨水溶液a 氨水溶液c均為氨水溶液，為便于區分不同步驟加入的量不同而命名，字母本身沒有含義。與現有技術相比，本專利技術有本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種Thermus脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述方法為：將氨基化納米磁性載體Fe3O4/SiO2與pH8.0的緩沖溶液混合，加入質量濃度25%的戊二醛水溶液，室溫下磁力攪拌4h，再加入以所述Tris?HCl緩沖溶液溶解的Thermus脂肪酶（Thermus?thermophilus?WL）的緩沖溶液，室溫下磁力攪拌3.5h，磁分離，棄去上清液a，將沉淀a用緩沖溶液洗滌，冷凍干燥，獲得固定化的Thermus脂肪酶；所述Thermus脂肪酶按下述方法獲得：將序列號為AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因以大腸埃希氏桿菌為宿主細胞進行重組，獲得含有Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏桿菌CGMCC?NO：1.12252；將含有Thermus脂肪酶基因的大腸埃希氏桿菌CGMCC?NO：1.12252的單菌落接種于LB液體培養基中，37℃、250rpm培養4h，獲得培養液a，取培養液a以體積分數1%的接種量接種于新鮮LB液體培養基中，37℃、250rpm培養3h，獲得培養液b，在培養液b中加入異丙基?β?D?硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為0.5mM，37℃下培養4h，離心，將沉淀b加入pH7.9的Buffer?A緩沖液中，在10KHz頻率下進行超聲裂解，離心，取上清液b進行Ni柱親和層析，洗脫液經透析后，取截留液冷凍干燥，獲得所述Thermus脂肪酶。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：章曉波，宋崇富，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：
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