本發(fā)明專利技術提供了在真核細胞中獲得位點特異性重組的方法，所述方法包括：提供包含第一重組附著位點和第二重組附著位點的真核細胞；將所述第一和第二重組附著位點與原核重組酶多肽接觸，導致在所述重組附著位點之間產(chǎn)生重組，其中重組酶多肽能夠介導第一和第二重組附著位點之間的重組。本發(fā)明專利技術也描述了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞、組織、植物和動物的組合物、載體和其使用方法。本發(fā)明專利技術的組合物、載體和方法也可用于基因治療用途。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程領域。具體而言，本專利技術涉及用于在細胞基因組中進行多核 苷酸的位點特異性整合、刪除、倒位、交換和易位的組合物和方法。本專利技術也涉及酶、多核苷酸、多肽和載體構建物。
技術介紹
許多噬菌體和整合型質(zhì)粒編碼位點特異性重組系統(tǒng)，這使得能夠?qū)⑺鼈兊幕蚪M穩(wěn)定地整合入它們宿主的基因組中，并將它們的基因組從宿主基因組切除。在這些系統(tǒng)中，對于重組反應的最小要求是重組酶和兩個重組位點，其中重組酶催化重組事件(Sadowski(1986)J. Bacteriol. 165:341-347 ；Sadowski(1993)FASEB J.7:760-767)。對于噬菌體整合系統(tǒng)而言，這些是指附著(att)位點，來自噬菌體DNA的attP元件以及在細菌基因組中存在的attB元件。這兩個附著位點可能共有少至幾個堿基對的序列同一性。重組酶蛋白與兩個att位點結合，并催化DNA鏈的保守性和互換性交換，這導致環(huán)狀噬菌體或質(zhì)粒DNA整合入宿主DNA。也可能需要其他噬菌體或宿主因子，諸如DNA結合蛋白IHF、整合宿主因子，以獲得有效率的反應(Friedman(1988)CelI 55:545-554;Finkel& Johnson(1992)Mol. Microbiol. 6:3257-3265)。在噬菌體生長循環(huán)的裂解階段，噬菌體整合酶，與其他宿主和/或噬菌體因子聯(lián)合起來，也將噬菌體基因組從細菌基因組切割下來。已經(jīng)開發(fā)出若干方法，從而使得能對哺乳動物基因組進行操作，以便闡明特定的感興趣基因的相關性和功能。在這些方法中，轉(zhuǎn)基因小鼠株和基因靶向技術的開發(fā)已經(jīng)證明是特別有用的(Brandon, E. P. , Idzerda, R. L. and McKnight, G. S. (1995) CurrBiol, 5, 625-34 ; Brandon, E. P. , Idzerda, R. L. and McKnight, G. S. (1995) Curr Biol,5，758-65)。伴隨著位點特異性重組酶的表征和應用，這些技術已經(jīng)取得了新的進步(Kilby, N. J. , Snaith, M. R. and Murray, J. A. (1993) Trends Genet, 9, 413-21)。位點特異性重組酶可以分為兩個主要家族。第一個家族(Int家族或酪氨酸重組酶家族)包括這些酶，它們催化或者位于相同DNA分子中的位點之間的重組(分子內(nèi)重組，導致分離、切除或倒位)或位于不同DNA分子中的位點之間的重組(分子間重組，導致整合)(Sauer, B. (1993)Methods EnzymoI, 225, 890-900 ；Dymecki, S.Μ. (1996)Proc Natl Acad Sci USA, 93, 6191-6 ；Abremski, K. and Hoess, R. (1984)J BiolChem, 259, 1509-14 ；Nash, H. A. (1996)in Escherichia coli and Salmonella cellularand molecular biology. , ed. F. C. Neidhart, R.1. Curtis, J. L.1ngraham, E. C. C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, ff. S. Rezaikof f, M. Ri ley, M. Schaechter and H. E. Umbager (A.S. M. Press, Washington D. C.)，pp. 2363-7)。后一特性已被開發(fā)利用，使得能將特異性序列革巴向插入到精確的位置(Sauer, B. and Henderson, N. (1990) The New Biologist, 2，441-9 ；Fukushige, S. and Sauer, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 89, 7905-9)。已被用于操作哺乳動物基因組的重組酶主要是Cre蛋白和Flp蛋白，它們屬于Int家族(Kilby，N.J. , Snaith, M. R. and Murray, J. A. (1993) Trends Genet, 9, 413-21)。這些酶的目標序列，對于Cre酶而言稱為IoxP位點，對于Flp酶而言稱為FRT,由短的反向重復組成，蛋白與反向重復結合。在基因組的長距離(高達70kb)上，重組過程是可操作的。通過使用這些酶，有若干作者已經(jīng)報道了在鼠模型中的位點特異性和組織特異性DNA重組(DiSanto, J. P.，Muller, W.，Guy, G. D.，F(xiàn)ischer, A. and Rajewsky, K. (1995)Proc NatlAcad Sci USA, 92, 377-81 ；Gu, H. , Marth, J. D. , Orban, P. C, Mossmann, H. and Rajewsky, K.(1994) Science, 265, 103-6 ；Kuhn, R. , Schwenk, F. , Aguet, M. and Rajewsky, K. (1995)Science, 269, 1427-9 ；Orban, P. C, Chui, D. and Marth, J. D. (1992) Proc. Natl. Acad. Sc1.USA, 89, 6861-5),植物和動物中的染色體異位(Deursen, J. v. , Fornerod, Μ. , Rees, B.ν. and Grosveld, G. (1995) Proc. Natl. Acad Sc1. USA, 92, 7376-80 ；Medberry, S. L. , Dale, E. , Qin, M. and Ow, D. ff. (1995) Nucleic Acids Res, 23, 485-90 ；0sborne, B. L, ffirtz, U. and Baker, B. (1995) Plant J，7，687-701)，特定基因的靶向誘導(Pichel, J.G. , Lakso, M. and ffestphal, Η. (1993) Oncogene, 8, 3333-42)。Cre-1oxP 系統(tǒng)已經(jīng)與誘導型啟動子，如干擾素Y誘導型啟動子聯(lián)合應用，用于促進在肝臟中高效率地進行基因敲除，但使得基因敲除在其他組織中處于較小程度(Kuhn, R.，Schwenk, F.，Aguet, M. andRajewsky, K. (1995) Science, 269, 1427-9)。然而，位點特異性重組系統(tǒng)在相同的基因組中僅僅使誘導數(shù)量減少的重組事件成為可能。鑒于每一重組反應將處于基因組的交換位點處的目標序列交給重組酶處理，并且因為重組酶(例如Cre和Flp)能夠催化分子間重組，所以整個過程可能導致不期望的染色體重排。重組酶的第二個家族統(tǒng)稱為解離酶/轉(zhuǎn)化酶家族或絲氨酸家族(Grindley，N.D. F. (1994)于 Nucleic本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
在真核細胞中獲得位點特異性重組的方法，所述方法包括：提供包含第一重組位點和第二重組位點的分離的真核細胞；將所述第一和第二重組位點與原核重組酶多肽接觸，從而在所述重組位點之間產(chǎn)生重組，其中所述重組酶多肽能夠介導所述第一和第二重組位點之間的重組，所述第一重組位點是噬菌體基因組重組附著位點(attP)或細菌基因組重組附著位點(attB)，所述第二重組位點是attB或attP，所述重組酶選自化膿性鏈球菌（Streptococcus?pyogenes）噬菌體重組酶或枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）噬菌體重組酶，條件是當?shù)谝恢亟M附著位點是attB時，所述第二重組附著位點是attP；當?shù)谝恢亟M附著位點是attP時，第二重組附著位點是attB。
【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：M·帕迪達姆，
申請(專利權)人：英特拉克森公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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