一種海參體壁總DNA提取方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種海參體壁總DNA提取方法。它包括樣品預(yù)處理、樣品的裂解、樣品消化液用氯仿：異戊醇抽提，含有DNA的水相加入等體積的異丙醇高鹽溶液，-20℃下放置20min，12000-13000g/min離心12-15min，棄上清，取DNA沉淀；所述的異丙醇高鹽溶液是由異丙醇和5mol/L?NaCl按體積比3：1混合而成；用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇水溶液的洗滌DNA沉淀，然后12000-13000g/min離心3-5min，棄上清；重復(fù)操作2-3次，將DNA沉淀干燥，再用0.1×TE溶液充分溶解保存。因此利用本發(fā)明專利技術(shù)的海參體壁總DNA提取方法能夠高質(zhì)量的提取到海參DNA，其DNA純度高，避免了粘多糖、膠原蛋白和色素等影響，能滿足后續(xù)PCR等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種海參體壁總DNA提取方法。
技術(shù)介紹
海參體壁中含有豐富的膠原、黏多糖和多種微量元素，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值。在我國被認(rèn)為是傳統(tǒng)的美味和滋補(bǔ)品。全球可供食的海參種類約50多種，作為名貴的海產(chǎn)品，市場上海參通常加工為干品或凍品出售，海參經(jīng)過多道工序加工成干品后，很難從外部形體上分辨出其種類。目前在市面上銷售的海參產(chǎn)品，大多根據(jù)其顏色和產(chǎn)地來命名貼標(biāo)，如“美國紅參”、“非洲海參”等，缺乏規(guī)范的商品命名，海參市場貼標(biāo)混亂。 根據(jù)海參線粒體DNA片段如COI和16S rDNA序列,可以從分子水平鑒定海參種類和開發(fā)出簡便的種類鑒別方法。由于海參含有豐富的黏多糖和蛋白質(zhì)，造成DNA的提取比較困難，尤其是高質(zhì)量DNA的獲得，DNA中多糖等雜質(zhì)過多會影響后續(xù)PCR擴(kuò)增等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而影響了海參種類的分子鑒定。另外，干海參經(jīng)過加工處理，其核基因組DNA已降解，與核基因組DNA相比，線粒體DNA結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定，拷貝數(shù)多，可以用于海參種類的分子鑒定。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，提供一種能對海參酒精保存樣品和干品均適用的海參體壁總DNA提取方法，該方法提取的DNA純度高，避免了粘多糖、膠原蛋白和色素等影響，能滿足后續(xù)PCR等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。本專利技術(shù)的海參體壁總DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟(a)樣品預(yù)處理第一步是將海參的酒精保存樣品用PBS溶液置換出酒精，或?qū)⒑⒏善酚肞BS溶液浸發(fā)，將第一步處理好的樣品在高鹽緩沖液中剪碎樣品，然后固液分離，棄液相取剪碎的固體樣品作為預(yù)處理后的樣品；所述的高鹽緩沖液為200mmol/LTris-HCl, 50mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, O. 2% β -巰基乙醇，余量為水，pH 8. O ；(b)樣品的裂解將預(yù)處理后的樣品加入到裂解液中，再加入適量的蛋白酶K降解蛋白質(zhì)，65 消化3(T60min,每隔5 IOmin混勻一次,待樣品消化徹底后，12000g/min離心2 3min，上層形成一層懸浮粘稠物，取下層澄清的樣品消化液；所述的裂解液為IOOmmol/LTris-HCl, 20mmol/L EDTA,1. 4mol/L NaCl,2%CTAB, 1%PVP, 1%SDS,0. 2%β -巰基乙醇，余量為水；(C)樣品消化液用氯仿異戊醇抽提，含有DNA的水相加入等體積的異丙醇高鹽溶液，-20°C下放置20min，12000-13000g/min離心12_15min，棄上清，取DNA沉淀；所述的異丙醇高鹽溶液是由異丙醇和5mol/L NaCl按體積比3 1混合而成；(d)用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇水溶液的洗滌DNA沉淀，然后12000-13000g/min離心3-5min,棄上清；重復(fù)操作2_3次，將DNA沉淀干燥，再用O.1 X TE溶液充分溶解保存。所述的步驟(a)的將海參的酒精保存樣品用PBS溶液置換出酒精優(yōu)選為取海參的酒精保存樣品在PBS溶液中放置3-6min，期間更換PBS溶液2次；所述的步驟(a)的將海參干品用PBS溶液浸發(fā)是將海參干品在PBS溶液放置30-60min，期間更換PBS溶液2次；所述的步驟(a)的固液分離是在10000-12000g/min離心l_2min,棄上清液；重復(fù)操作2次。所述的步驟(C)的樣品消化液用氯仿異戊醇抽提優(yōu)選為樣品消化液中加入等體積的體積比為24:1的氯仿異戍醇中，充分混勻，靜止l_2min, 12000-13000g/min離心12-15min，取上清液；重復(fù)操作2_3次。本專利技術(shù)中的PBS溶液是現(xiàn)有技術(shù)中的產(chǎn)品，其為137mmol/L NaCl,2. 7mmol/L KCl,IOmmoI/L Na2HP04，2mmol/L KH2PO4,余量為水，ρΗ7· 2。本專利技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)(I)使用PBS置換出酒精保存樣品中酒精和浸發(fā)干海參樣品，可提高提取DNA的獲·得量；(2)在高鹽緩沖液中剪碎組織樣品，可除去樣品中胞外多糖和色素等，降低它們對提取DNA的影響；(3)樣品裂解液為添加SDS的CTAB抽提緩沖液，即可快速的裂解組織，又有利于去除多糖；(4)異丙醇高鹽溶液沉淀DNA，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，消除多糖對DNA質(zhì)量的影響；因此利用本專利技術(shù)的海參體壁總DNA提取方法能夠高質(zhì)量的提取到海參DNA，其DNA純度高，避免了粘多糖、膠原蛋白和色素等影響，能滿足后續(xù)PCR等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。附圖說明圖1是本專利技術(shù)的實(shí)施例1和3提取并純化出的海參體壁總DNA瓊脂糖電泳圖。M :DNA Marker(DL15000), 1-4 :花刺參酒精保存樣品提取的DNA，5_8 :墨西哥刺參干品提取的DNA。圖2是以本專利技術(shù)的實(shí)施例1和3提取DNA為模板COI擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖。M DNA Marker (DL2000)，1-4 :花刺參酒精保存樣品提取DNA為模板的COI擴(kuò)增產(chǎn)物，5-8 墨西哥刺參干品提取DNA為模板的COI擴(kuò)增產(chǎn)物。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對本專利技術(shù)的進(jìn)一步說明，而不是對本專利技術(shù)的限制。實(shí)施例1:(I)樣品預(yù)處理材料為花刺參(Stichopus monotuberculatus)酒精保存樣品，用剪刀取樣品40mg，放入 L 5ml 離心管中，加入 800μ I PBS 溶液(137mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCl，IOmmoI/LNa2HPO4, 2mmol/L KH2PO4,余量為水，pH 7. 2)，放置 3min，期間更換 PBS 溶液 2 次，得到處理后的樣品。隨后剪取處理后的樣品60mg，放入1. 5ml離心管中，加入1000 μ I高鹽緩沖液中(200mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 0. 2%β-巰基乙醇，余量為水，pH 8. O，％指的是質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))，充分剪碎樣品，12000g/min離心lmin，棄上清液；重復(fù)操作2次，取沉淀，得到的沉淀即為預(yù)處理后的樣品。(2)樣品裂解樣品裂解液為添加了 SDS的CTAB抽提緩沖液(100mmol/L Tris-HCl, 20mmol/LEDTA,1. 4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP, 1%SDS,0. 2%β -巰基乙醇，余量為水，% 指的是質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))，加熱至65°C，混勻；向預(yù)處理后的樣品中加入800 μ I預(yù)熱的裂解液和20 μ I20mg/ml蛋白酶K，放置在65°C金屬浴上，消化40min，每5min混勻一次。待樣品消化徹底后，12000g/min離心2min，上層將形成一層懸浮粘稠物，用移液器吸取下層澄清的樣品消化液，轉(zhuǎn)入新的離心管中。(3)氯仿異戊醇抽提向樣品消化液中加入等體積的氯仿異戊醇(體積比24:1 )，充分混勻，靜止lmin，12000g/min離心15min，用粗口槍頭移液器輕吸上清，轉(zhuǎn)入新的離心管；重復(fù)操作2次，得上清液。(4)異丙醇高鹽沉淀DNA向上清液中加入等體積異丙醇高鹽溶液(異丙醇和5mol/L NaCl按體積比3 1混合而成)，混勻，_20°C下放置20min ;12000g/min本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種海參體壁總DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟：（a）樣品預(yù)處理：第一步是將海參的酒精保存樣品用PBS溶液置換出酒精，或?qū)⒑⒏善酚肞BS溶液浸發(fā)，將第一步處理好的樣品在高鹽緩沖液中剪碎樣品，然后固液分離，棄液相取剪碎的固體樣品作為預(yù)處理后的樣品；所述的高鹽緩沖液為：200mmol/L?Tris?HCl,50mmol/L?EDTA,500mmol/L?NaCl,0.2%β?巰基乙醇，余量為水，pH8.0；（b）樣品的裂解：將預(yù)處理后的樣品加入到裂解液中，再加入適量的蛋白酶K降解蛋白質(zhì)，65℃消化30~60min，每隔5~10min混勻一次，待樣品消化徹底后，12000g/min離心2~3min，上層形成一層懸浮粘稠物，取下層澄清的樣品消化液；所述的裂解液為100mmol/LTris?HCl，20mmol/L?EDTA，1.4mol/L?NaCl，2%CTAB，1%PVP，1%SDS，0.2%β?巰基乙醇，余量為水；（c）樣品消化液用氯仿：異戊醇抽提，含有DNA的水相加入等體積的異丙醇高鹽溶液，?20℃下放置20min，12000?13000g/min離心12?15min，棄上清，取DNA沉淀；所述的異丙醇高鹽溶液是由異丙醇和5mol/L?NaCl按體積比3：1混合而成；（d）用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇水溶液的洗滌DNA沉淀，然后12000?13000g/min離心3?5min，棄上清；重復(fù)操作2?3次，將DNA沉淀干燥，再用0.1×TE溶液充分溶解保存。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：夏建軍，胡超群，張呂平，王艷紅，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院南海海洋研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：