一種底物親和力強的甘露聚糖酶的設(shè)計與制備。本發(fā)明專利技術(shù)提出了一種底物親和力強的AusMan5AY111F與AusMan5AY115F突變酶的設(shè)計與構(gòu)建的方法，通過序列同源性分析、同源建模、結(jié)合能的計算等最終確定突變位點，大引物PCR得到的相應(yīng)的基因命名為Ausman5AY111F、man5AY115F。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了突變酶工程菌的構(gòu)建以及高效表達和純化的方法，制備的突變酶具有底物親和力強、催化效率高的特性，具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟價值。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及基因工程和蛋白質(zhì)表達領(lǐng)域，尤其涉及AuSMan5AY111F和AusMan5AY115F 酶基因的構(gòu)建和表達，以及該酶的性質(zhì)和制備的研究。
技術(shù)介紹
β -甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannohydrolase, EC 3.2.1.78)是一種能從均一甘露聚糖和異甘露聚糖主鏈的內(nèi)部降解β_1，4-甘露糖苷鍵的水解酶，屬于半纖維素酶類，其廣泛地存在于微生物、植物和動物中。它可以廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、造紙、印染和石油工業(yè)等領(lǐng)域。在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，β-甘露聚糖酶作用于甘露聚糖后可以產(chǎn)生功能性低聚糖，這種低聚糖可以有效地降低人體血糖和膽固醇水平且有利于人和動物腸道內(nèi)益生菌群的生長，進而調(diào)節(jié)人和動物的免疫系統(tǒng)、提高免疫力。在飼料工業(yè)中，它作為飼料添加劑能有效降解植物細胞壁中的甘露聚糖成分，消除抗營養(yǎng)因子，提高能量利用率、改善飼料轉(zhuǎn)化率。在造紙工業(yè)中，β_甘露聚糖酶和β_木聚糖酶等半纖維素降解酶類協(xié)同使用， 處理紙漿，能明顯改善紙質(zhì)。將β_甘露聚糖酶運用紡織印染的漂白工藝中，能有效地去除產(chǎn)品上粘附的多余染料，更可以減少氯和堿的用量以及它們帶來的環(huán)境污染問題，有利于生態(tài)環(huán)境的保護。目前已報道的能產(chǎn)β_甘露聚糖酶的微生物主要來自于細菌、真菌和放線菌，例如細菌中的枯草芽孢桿菌，真菌中的曲霉、木霉、青霉、酵母，以及放線菌中的鏈霉菌等。目前，關(guān)于第5家族β -甘露聚糖酶的報道較多，它們的最適pH值為3. O 7. 5，最適溫度在45 92°C。近年來，隨著對自然界中半纖維素資源的開發(fā)、飼糧中甘露聚糖抗營養(yǎng)因子的消除以及甘露寡糖生理功能的 發(fā)現(xiàn)，甘露聚糖酶的需求量越來越大，導(dǎo)致對甘露聚糖酶的研究和開發(fā)進入一個新高潮。但就國內(nèi)外相關(guān)文獻或?qū)＠麍蟮纴砜矗⑸铴耞甘露聚糖酶發(fā)酵酶活性普遍不高，導(dǎo)致了生產(chǎn)成本很高，從而阻礙了該酶在眾多領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。為了提高甘露聚糖酶的發(fā)酵產(chǎn)率和酶活性，早期的研究工作主要集中在產(chǎn)酶菌種的篩選、誘變、產(chǎn)酶誘導(dǎo)，酶的分離純化及性質(zhì)，酶水解底物方式及應(yīng)用等方面。進入90 年代，隨著基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，研究工作逐步轉(zhuǎn)向酶基因的克隆和表達以及酶活性位點的研究等方面。目前，雖已有一些有關(guān)甘露聚糖酶基因的克隆和表達的文獻和專利報道，但有關(guān)基于理性設(shè)計的甘露聚糖酶的分子改造，尤其是關(guān)于甘露聚糖酶親和力的分子改造研究未見有報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種底物親和力不同的AuSMan5AY111F和AusMan5AY115F酶的設(shè)計與構(gòu)建的方法，對原有的宇佐美曲霉Man5A進行了分子改造。本專利技術(shù)的技術(shù)方案綜合考慮分子對接、同源建模、結(jié)合能計算、同源性分析等因素確定宇佐美曲霉AusMan5A基因突變位點，設(shè)計特異性突變引物，構(gòu)建突變酶基因 AusMan5AY111F和AusMan5Ayi15f,并成功實現(xiàn)其在畢赤酵母中的表達及酶動力學(xué)參數(shù)的測定。攜帶有宇佐美曲霉Aus Man5A基因的重組質(zhì)粒pUCm-T_man5A由江南大學(xué)構(gòu)建和保藏(專利申請?zhí)?201010550927. 4)。所述的突變酶的活性測定方法于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 4. 8乙酸-乙酸鈉緩沖液配制的質(zhì)量濃度為O. 5%的角豆膠溶液2. 4mL，50°C預(yù)熱lOmin，在A管中加入O.1mL適當(dāng)稀釋的酶液，50°C 準確反應(yīng)IOmin ;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加 O.1mL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從甘露糖標準曲線上查出相應(yīng)的還原糖(以甘露糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分鐘產(chǎn)生I μ mol還原糖所需的酶量定義為I個β -甘露聚糖酶活性單位(IU)。所述的酶基因的構(gòu)建和表達的方法(I)突變位點的確定根據(jù) Carbohydrate-Active enzymes Database (http:// WWW. cazy. org/)中收錄的信息,收錄與Km值有關(guān)地文獻。(2)甘露聚糖酶與甘露二糖的對接和分子動力學(xué)模擬同源建模獲得AusMan5A及的三維結(jié)構(gòu)，與甘露二糖用Aut0D0Ck4. 2軟進行分子對接，統(tǒng)計出結(jié)合域距酸堿催化位點親核催化位點8A內(nèi)的氨基酸，同源性分析排除保守位點氨基酸，根據(jù)氨基酸的性質(zhì)、空間結(jié)果及位置等選擇多個點進行同源建模，獲得突變酶的三維結(jié)構(gòu)，并計算原酶及突變酶與甘露二糖之間的結(jié)合能，綜合以上因素選擇分別將111、115位酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?3)突變酶AusMan5AY111F和AusMan5AY115F基因的獲得基于上面設(shè)計的突變位點， 設(shè)計并合成特異性定點突變引物如下Y115F 5/ -ACGCAGACATACCACCAAAATCGGTCCAGT-3'，宇佐美曲霉 Aus Man5A 的基因片段的中間特異性引物；YlllF 5/ -AATCGGTCCAGAAGTTGACGAAGT-3'，宇佐美曲霉 Aus Man5A 的基因片段的中間特異性引物；·根據(jù)原酶基因序列設(shè)計并合成上下游引物如下AMan5A-F 5/ -GAATTCTCCTTCGCCAGCACCTC-3'，宇佐美曲霉 Aus Man5A 的基因片段的上游引物；AMan5A-R 5/ -TTGTACCGCCGGCACTATCAATAGCAGCAA-3 '，宇佐美曲霉 Aus Man5A 的基因片段的下游引物；先分別以pUCm-T-man5A為模板以上游引物和中間特異性引物為引物PCR合成大引物，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析并割膠回收目的條帶。然后各取2μ1大引物、O. 5 μ I下游引物以pUCm-T-man5A為模板進行PCR獲得突變酶基因，將PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-man5AY111F、 pUCm-T-man5AY115F)，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選選擇正確的重組子送上海生工測序。將測序結(jié)果正確的pUCm-T-man5AY111F、pUCm-T-man5AY115F 與 pPIC9K 質(zhì)粒均用 EcoR I和Not I進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-man5AY111F、pPIC9K_man5AY115F(圖1)，并對重組質(zhì)粒進行序列測定。(4)GS115/man5AY111F、GS115/man5AY111F 的構(gòu)建、表達、產(chǎn)物純化及活性測定用 SalI分別對pPIC9K-man5AY111F、pPIC9K_man5AY115F進行線性化,按照畢赤酵母表達手冊進行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/man5AY111F、GS115/man5AY111F ;按照手冊上的標準流程進行誘導(dǎo)表達，用DNS法測定突變酶的甘露聚糖酶活性；發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心、硫酸銨鹽析、離子交換層析和凝膠過濾層析，得到電泳純的突變酶。(5)突變酶動力學(xué)常數(shù)的測定分別取不同濃度的角豆膠(I 10mg/mL)按照酶活測定的條件測定水解反應(yīng)速率，然后用雙倒數(shù)作圖的方法算出Km和本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus?usamii)E001的甘露聚糖酶的定向改造酶AusMan5AY111F和AusMan5AY115F，其核苷酸序列對應(yīng)于序列表中的SEQ?ID?NO：1和SEQ?IDNO：3。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李劍芳，胡蝶，汪俊卿，魏喜換，趙梅，鄔敏辰，
申請(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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