一種融合蛋白包涵體的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種融合蛋白包涵體的制備方法，包括以下幾個(gè)步驟：工程菌破碎步驟、包涵體的洗滌步驟、包涵體變性溶解和過濾步驟。本發(fā)明專利技術(shù)的有益效果是：制備得到的包涵體變性溶解液的澄清度顯著增加，濾器過濾容量亦明顯增加。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及，尤其涉及一種適合工業(yè)化且低成本的Mtb72f融合蛋白包涵體的制備方法。
技術(shù)介紹
目前來說，高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌在大量合成異源蛋白質(zhì)時(shí)，一般情況下以包涵體的形式存在于細(xì)菌內(nèi)。包涵體由高度聚集的外源蛋白質(zhì)、核酸及蛋白質(zhì)合成酶及核糖體組成。其中大部分(50%以上)是克隆外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，它們具有工程菌 表達(dá)的外源基因的正確的氨基酸序列，但空間構(gòu)象往往是錯(cuò)誤的，因而沒有生物活性。由于包涵體位于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)且沒有生物活性，需經(jīng)細(xì)胞裂解后經(jīng)提取洗滌后變性復(fù)性及純化步驟方能得到有活性的蛋白質(zhì)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決以上技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供了，包括以下幾個(gè)步驟工程菌破碎步驟、包涵體的洗滌步驟、包涵體變性溶解和過濾步驟。優(yōu)選的，所述工程菌破碎步驟包括以下幾個(gè)步驟I)取Mtb72f工程菌菌株接種于發(fā)酵罐中按流加補(bǔ)料的方式進(jìn)行高密度發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵液0D65tol=50時(shí)加入IPTG于37°C進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)5小時(shí)后收獲菌體。按每IOOg菌體配IL的比例取一定量的菌體添加入預(yù)冷的裂解緩沖液(pH=7.0，IOmM bis-tris丙烷)中，得到菌體復(fù)溶液。將菌體復(fù)溶液用高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)處理，均質(zhì)后冷卻到5至10°C。2)將步驟I得到的樣品用高壓勻漿機(jī)進(jìn)行菌體破碎，所述高壓勻漿機(jī)壓力調(diào)節(jié)為一級(jí) 850-900 bars，二級(jí) 100_150bars、所述一級(jí)和二級(jí)的總壓力為 1000±50bars。3)將步驟2所得到的樣品再重復(fù)一次步驟2，處理完畢后獲得菌體破碎液；優(yōu)選的，所述包涵體的洗滌步驟包括以下幾個(gè)步驟4)將步驟3所得到的菌體破碎液中加入等體積的裂解緩沖液，混勻后用高速離心機(jī)收集包涵體沉定，離心結(jié)束后收集包涵體,添加包涵體清洗緩沖液(pH=7. O, 2M尿素，IOmMbis-tris丙燒)至步驟I中菌體復(fù)溶時(shí)相當(dāng)?shù)捏w積，用高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)處理，5)用離心機(jī)收集包涵體沉淀，再在包涵體沉淀中添加少量清洗緩沖液體后用高速均質(zhì)處理后制成包涵體懸液。優(yōu)選的，所述包涵體的變性溶解步驟包括將步驟4所述得到的包涵體懸液加入pH=7. O,濃度為8M尿素的包涵體變性緩沖液溶解完全；優(yōu)選的，所述過濾步驟包括將步驟4得到的包涵體變性液直接用濾器進(jìn)行澄清過濾;或者離心后取上清用濾器進(jìn)行澄清過濾。優(yōu)選的，步驟2中，所述樣品進(jìn)入所述高壓勻漿機(jī)時(shí)溫度應(yīng)控制在5至10°C，所述樣品出口時(shí)溫度為10至25°C。優(yōu)選的，收集包涵體沉定時(shí)的溫度為10至15°C。優(yōu)選的，離心過程中溫度為10至15°C。本專利技術(shù)為中國專利技術(shù)專利“用于治療或預(yù)防結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病的新方法”(中國專利申請(qǐng)?zhí)?00680023551. 3)相關(guān)專利，具體涉及表達(dá)Mtb72f多肽疫苗的大腸桿菌工程菌的裂解參數(shù)的優(yōu)化和相關(guān)的純化后復(fù)性工藝的優(yōu)化。200680023551. 3披露的Mtb72f生產(chǎn)工藝為E. coli工程菌的發(fā)酵及誘表達(dá)，收獲工程菌，細(xì)胞裂解，包涵體收獲及洗滌，包涵體在變性條件下溶解。其后，溶解的包涵體 經(jīng)過濾后直接進(jìn)行下游純化及用切向流過濾(超濾)進(jìn)行復(fù)性。原工藝所涉及的細(xì)胞裂解步驟為使用高壓均漿機(jī)進(jìn)行。其后，包涵體用離心機(jī)進(jìn)行收集并進(jìn)行清洗。清洗后的包涵體由包含尿素的變性緩沖液充分溶解并過濾后方能進(jìn)行下一步的純化步驟。披露的專利技術(shù)專利中高壓均質(zhì)機(jī)細(xì)胞破碎為實(shí)驗(yàn)室小型設(shè)備，處理量低；另一方面，壓力設(shè)為11，000± IOOpsi (即在750bar-760bar之間)，為了使工程菌破碎完全，需重復(fù)處理5次。而在操作過程中，為了保存目標(biāo)蛋白活性和質(zhì)量，每次破碎前需將懸液預(yù)冷至10°C以下，由于破碎的低效率和過于繁瑣的操作導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞裂解時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)影響蛋白的質(zhì)量，并且不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。故用工業(yè)級(jí)的高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行工藝放大時(shí)需調(diào)整壓力參數(shù)減少破碎次數(shù)。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，在使用存在一、二級(jí)分級(jí)調(diào)節(jié)閥為模式的工業(yè)級(jí)高壓均質(zhì)機(jī)時(shí)，在一級(jí)閥壓力大于或等于750 bar，總壓力為IOOObar的情況下，經(jīng)兩次處理工程菌細(xì)菌都能完全破碎，但將操作壓力限定在一個(gè)狹窄的范圍時(shí)(一級(jí)閥壓力為850bar-900bar，二級(jí)閥壓力為100bar-150bar)時(shí)，經(jīng)兩次破碎處理，下游制備得到的包涵體變性溶解液的澄清度顯著增加(濁度顯著下降)，濾器過濾容量亦明顯增加。更重要的是，下游純化結(jié)果表明目標(biāo)蛋白純度顯著提高。具體實(shí)施例方式對(duì)本專利技術(shù)的較優(yōu)的實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說明實(shí)施例1:菌體復(fù)溶取Mtb72f工程菌菌株接種于發(fā)酵罐中按流加補(bǔ)料的方式進(jìn)行高密度發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵液0D650nm=50時(shí)加入IPTG于37°C進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)5小時(shí)后收獲菌體。取一定量的菌體(彡16L發(fā)酵收獲時(shí)的菌體量)，加入預(yù)冷的裂解緩沖液，調(diào)節(jié)菌體復(fù)溶液至0D65(lnm ^ 60。將菌體復(fù)溶液用高速均質(zhì)機(jī)均質(zhì)處理，均質(zhì)后冷卻到< 10°C。實(shí)施例2菌體破碎將冷卻勻漿后的樣品用高壓勻漿機(jī)進(jìn)行菌體破碎，高壓勻漿機(jī)壓力調(diào)節(jié)為二級(jí)100-150bars、一級(jí)850-900 bars，破碎總壓力為1000±50bars ;勻漿機(jī)入口樣品溫度應(yīng)控制在< 10°C，出口樣品溫度必須< 25°C。同一批樣品破碎處理兩次，處理完畢后獲得菌體破碎液。實(shí)施例3菌體破碎液離心及清洗在菌體破碎液中加入同體積的裂解緩沖液，混勻后用工業(yè)規(guī)模的離心機(jī)(如管式高速離心機(jī))收集包涵體沉定，過程溫度小于15°C。離心結(jié)束后收集包涵體，添加包涵體清洗緩沖液至菌體復(fù)溶時(shí)相當(dāng)?shù)捏w積，用高速均質(zhì)(如Ultra Turrax T50)均質(zhì)處理,后用離心機(jī)收集包涵體沉淀，過程溫度同樣小于15°C。重復(fù)一次包涵體清洗和離心操作步驟。收集包涵體,添加少量清洗緩沖液體后用高速均質(zhì)處理后制成包涵體懸液交純化工序。實(shí)施例4:包涵體變性溶解及過濾緩慢將包涵體懸液樣品滴加入包涵體溶解緩沖液中(體積為對(duì)應(yīng)的菌體收獲液的1/2)，攪拌器300rpm、室溫不斷攪拌約2h。然后進(jìn)行包涵體變性液過濾。料液可直接用深層濾器(如PALL公司的Supracap系列)進(jìn)行澄清過濾；亦可采用離心(如8000g離心15min)后取上清用囊式濾器進(jìn)行澄清過濾。濾液的濁度應(yīng)小于10NTU，用于包涵體目標(biāo)蛋白的純化。實(shí)施例5 處理16L菌液對(duì)應(yīng)的菌體菌體復(fù)溶，細(xì)胞破碎參數(shù)為第一次破碎一級(jí)閥壓力750bars，二級(jí)閥壓力200bars ;第二次破碎一級(jí)閥壓力900bars, 二級(jí)閥壓力100bars。實(shí)施例6處理16L菌液對(duì)應(yīng)的菌體菌體復(fù)溶。菌體破碎時(shí)，細(xì)胞破碎參數(shù)為一級(jí)閥壓力900bars，二級(jí)閥壓力IOObars,破碎操作兩次。實(shí)施例5和實(shí)施例6的包涵體所用的高壓均質(zhì)機(jī)為Niro Soavi公司。實(shí)施例5和實(shí)施例6具有相同的離心及清洗操作在菌體破碎液中加入同體積的裂解緩沖液，混勻后用管式高速離心機(jī)(型號(hào)GQ75，16500g，進(jìn)料速度400ml/min)收集包涵體沉定，過程溫度小于15°C。離心結(jié)束后收集包涵體，添加包涵體清洗緩沖液至菌體復(fù)溶時(shí)相當(dāng)?shù)捏w積，用高速均質(zhì)(如Ultra Turrax T50)均質(zhì)處理,后用管式高速離心機(jī)(型號(hào)GQ75, 16500g，進(jìn)料速度200ml/min)收集包涵體沉淀，過程溫度同樣小于15°C。重復(fù)一次包涵體清洗和離心操作步本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種融合蛋白包涵體的制備方法，其特征在于，包括以下幾個(gè)步驟：工程菌破碎步驟、包涵體的洗滌步驟、包涵體變性溶解和過濾步驟。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：丘力功，韋劍，魏榮華，黃明，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：