乳糖代替IPTG誘導重組雞α干擾素在大腸桿菌中的表達制造技術

本發明專利技術公開一種乳糖代替IPTG作為誘導劑誘導pET28a載體生產重組雞α干擾素的方法。對乳糖誘導的時機、乳糖濃度、誘導持續時間條件進行研究，確定了乳糖誘導的最佳條件。結果表明，乳糖能有效地誘導重組α干擾素表達的表達，并且目的蛋白的表達量高于IPTG的誘導量。生產成本降低10%左右，菌體量提高20%，同時乳糖不會對環境造成污染。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于基因工程藥物制備領域，更具體地，本專利技術涉及一種利用乳糖代替IPTG生產重組雞α干擾素的方法。
技術介紹
干擾素(interfeixm，IFN)是一類重要的細胞因子，具有廣譜的抗病毒、抗細胞增殖、免疫調節等多種生物活性。動物機體受到病毒感染后干擾素從細胞內釋放出來，可保護與其接觸的其他細胞不受感染。由于天然干擾素在生物體內含量少且不易提取，在應用中受到限制。20世紀70年代起，科學家開始探索利用基因工程的方法來改造干擾素及其表達系統，取得了很大進步。在我國，禽類干擾素的研究起步比較晚。目前，市售的干擾素價格高昂，與動物價格低廉存在著尖銳的矛盾，無法在獸醫臨床上廣泛應用。利用基因工程技術選擇一個合適的系統，使其得到高效表達，生產具有廉價、廣譜抗病毒活性、無毒害、無殘留等優點的干擾素無疑是促使干擾素在獸醫臨床上推廣應用的有效途徑。目前工業生產中大多使用大腸桿菌作為工程菌來生產目的蛋白。大腸桿菌作為工程菌表達目的蛋白主要有兩個優勢一是大腸桿菌具有遺傳背景清楚，易于控制基因的表達；二是大腸桿菌容易培養，可以獲得較高產量的目的蛋白。乳糖(Lac)操縱子是研究的最為詳盡的大腸桿菌基因操縱子，目前利用乳糖操縱子調控機理為基礎設計和構建的表達系統已得到了廣泛應用。Novagen公司的pET系列大腸桿菌表達體系利用IPTG誘導lacUV5啟動子來過量表達T7RNA聚合酶，從而產生大量的目的蛋白。IPTG可作為乳糖操縱子的安慰性誘導劑，且不會被菌體所分解利用，不會帶來復雜的代謝動力學影響，但其價格昂貴又有潛在毒性，而乳糖具備無毒和價廉的優點，使得其在重組蛋白的大規模發酵生產中，具有潛在價值和優勢。本試驗選用乳糖作為誘導劑探索其對干擾素蛋白誘導表達的最優化條件。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是利用基因重組技術，構建了含雞α干擾素的重組質粒，克服了天然干擾素在體內含量少且不易提取等缺點，為雞α干擾素的大規模生產奠定了基礎。本專利技術的另一目的是克服了現有技術的缺陷和不足之處，提供一種利用乳糖誘導性表達載體生產重組雞α干擾素的方法。本專利技術的目的是由以下技術方案實現的 (I)將已構建好含雞α干擾素的重組質粒的宿主菌進行活化，制備種子液。(2)乳糖最佳誘導濃度確定以小三角瓶培養菌體，分別向處于最佳生長期的菌體培養基中加入乳糖，使乳糖終濃度分別為O. 5%、1%、2%、4%、8%，同時以加入O. 2mM/L的IPTG作為陽性對照，37°C，250rpm振蕩培養4h，同時用未誘導的菌液作為陰性對照。(3)菌體最佳誘導時機確定菌體生長情況以0D_值來確定。以小三角瓶培養菌體，分別在菌體生長至OD600值為O. 4,0. 6,0. 8、1. O、1. 2、1. 4、1. 6時，向培養基中加入濃度為2%的乳糖，37°C誘導4h后，目的蛋白表達情況以誘導后的菌體全蛋白進行SDS-PAGE電泳，通過凝膠成像系統進行目的蛋白占總蛋白的比例的分析。(4)乳糖最佳誘導時間確定根據以上試驗所確定的條件，在小三角瓶培養的菌體中加入乳糖進行誘導，于37°C分別誘導1、2、3、4、6、8、IOh，觀察目的蛋白的表達量。本專利技術的優點在于 (I)本專利技術成功運用乳糖代替IPTG作為誘導劑來誘導目的蛋白的表達。(2)通過本專利技術所述的技術方案，大腸桿菌BL21 (DE3)菌體得率高，菌體濕重達40-80g/L。(3)本專利技術的目的蛋白表達水平高，目的蛋白占菌體總蛋白的水平可達11-15%，與IPTG誘導水平相當。(4)本專利技術利用乳糖誘導蛋白表達外，它還能大幅提高菌的生物量。(5)本專利技術所述的發酵方法簡便，發酵時間短，生產成本低，此外，無IPTG存在，后處理簡單。附圖說明圖1，不同乳糖濃度和IPTG誘導后的蛋白表達情況，其中泳道M為蛋白Marker，泳道1-7依次分別為未誘導、O. 2mMIPTG誘導、O. 5%乳糖誘導、1%乳糖誘導、2%乳糖誘導、4%乳糖誘導、8%乳糖誘導。圖2，添加乳糖誘導不同時間的蛋白表達情況,其中泳道M為蛋白Marker，泳道I_8依次分別為添加乳糖誘導0h，lh, 2h, 3h, 4h, 6h, 8h, IOh。圖3，不同菌體生長階段加入乳糖誘導的目的蛋白占全菌總蛋白的比例。圖4，干擾素濃度測定標準曲線圖。具體實施例方式下面結合實施例和附圖對本專利技術做進一步詳細的描述。實施例1 雞α干擾素重組質粒的構建 參照NCBI中已發表雞α干擾素基因序列(ΑΒ021154)，利用Primer Premier 5. O軟件設計2對引物，用于擴增雞IFN-α全基因(CKF1和CKR1)和去信號肽的成熟蛋白編碼基因(CKF2和CKR2)。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。權利要求1.一種乳糖代替IPTG誘導重組雞α干擾素在大腸桿菌中的表達，其特征在于包括如下步驟(1)種子培養方法從-70°C冰箱中取出含雞α干擾素重組質粒的甘油保藏管I支，于冰水浴中解凍，混勻后以1%接種量轉接到50mlLB培養基中，在37°C的恒溫搖床中振蕩培養 12h，轉速為 200r/min;(2)發酵和誘導將經活化的種子液按1%的接種量接種于2L培養基中，37°C恒溫搖床中振蕩培養，轉速為200r/min，當菌體濃度達到一定OD值時，添加誘導劑乳糖，分別調整誘導劑濃度、誘導時機、誘導培養時間因素進行發酵培養，以誘導后目的蛋白的濃度作為依據，確定最佳誘導方案。2.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于所述的宿主菌為大腸桿菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3)，表達載體為 PET28a。3.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于菌體濃度分別為OD6tltl為O.4-1. 6時添加誘導劑。4.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于用Bradford法測定蛋白質濃度，以牛血清白蛋白作為標準蛋白。全文摘要本專利技術公開一種乳糖代替IPTG作為誘導劑誘導pET28a載體生產重組雞α干擾素的方法。對乳糖誘導的時機、乳糖濃度、誘導持續時間條件進行研究，確定了乳糖誘導的最佳條件。結果表明，乳糖能有效地誘導重組α干擾素表達的表達，并且目的蛋白的表達量高于IPTG的誘導量。生產成本降低10%左右，菌體量提高20%，同時乳糖不會對環境造成污染。文檔編號C12P21/02GK102994596SQ201210528728公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月11日 優先權日2012年12月11日專利技術者馬仲彬, 徐公豹, 李炳志, 李秋霞, 申艷敏, 王興濤, 王新娟 申請人:河南省康星藥業股份有限公司本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種乳糖代替IPTG誘導重組雞α干擾素在大腸桿菌中的表達，其特征在于包括如下步驟：（1）種子培養方法：從?70℃冰箱中取出含雞α干擾素重組質粒的甘油保藏管1支，于冰水浴中解凍，混勻后以1%接種量轉接到50mlLB培養基中，在37℃的恒溫搖床中振蕩培養12h，轉速為200r/min;（2）發酵和誘導：將經活化的種子液按1%的接種量接種于2L培養基中，37℃恒溫搖床中振蕩培養，轉速為200r/min,當菌體濃度達到一定OD值時，添加誘導劑乳糖,分別調整誘導劑濃度、誘導時機、誘導培養時間因素進行發酵培養，以誘導后目的蛋白的濃度作為依據，確定最佳誘導方案。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬仲彬，徐公豹，李炳志，李秋霞，申艷敏，王興濤，王新娟，
申請(專利權)人：河南省康星藥業股份有限公司，
類型：發明
國別省市：