在具有另外木糖異構酶活性的重組發酵單胞菌屬中改善的木糖利用制造技術

據發現，表達來自密蘇里游動放線菌的木糖異構酶的發酵單孢菌屬在生長于包含木糖的培養基時具有改善的木糖利用、生長和乙醇生產。通過分子系統發生分析和序型隱蔽馬爾科夫模型分析在結構上鑒定了與密蘇里游動放線菌的木糖異構酶相關的木糖異構酶，從而提供了可用于改善木糖利用的木糖異構酶。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】在具有另外木糖異構酶活性的重組發酵單胞菌屬中改善的木糖利用本申請要求2010年6月29日提交的美國臨時申請61/359463的權益，并且其全文以引用的方式并入。政府權利聲明本專利技術由美國政府支持通過能源部(theDepartmentofEnergy)授予的合同No.DE-FC36-07GO17056而完成。美國政府擁有本專利技術的必然權利。專利
本專利技術涉及微生物學和基因工程領域。更具體地，鑒定了在發酵單胞菌屬(Zymomonas)中具有高活性木糖異構酶，其提供了改善的木糖利用和乙醇生產。專利技術背景通過微生物生產乙醇提供了一種替代化石燃料的可供選擇的能源，因此成為當前研究的重要領域。理想的情況是，產生乙醇以及其它有用產物的微生物能夠利用木糖作為碳源，這是因為木糖是水解的木質纖維素生物質中的主要戊糖。生物質可提供豐富可用的低成本碳底物。已經對在天然情況下并不利用木糖的運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis)和其它細菌乙醇菌原進行基因工程改造以用于木糖利用，其通過導入編碼如下的基因：1)木糖異構酶，其催化木糖向木酮糖的轉化；2)木酮糖激酶，它將木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)轉酮醇酶；以及4)轉醛醇酶。所使用的編碼區一般來自大腸桿菌(E.coli)基因。對運動發酵單胞菌菌株進行木糖代謝的工程改造(US5514583，US5712133，US6566107，WO95/28476，Feldmann等人(1992)Appl.Microbiol.Biotechnol.，38：354-361，Zhang等人(1995)Science267：240-243)，以及對棕櫚發酵桿菌(Zymobacterpalmae)菌株的工程改造(Yanase等人(2007)Appl.Environ.Mirobiol.73：2592-2599)已經獲得成功。然而，工程化的菌株通常不像在葡萄糖上那樣在木糖上生長并且產生乙醇。已經通過在木糖培養基上進行的連續傳代而馴化了針對木糖利用進行工程改造的菌株，其產生了具有改善的木糖利用的菌株，如美國專利7,223,575和美國專利7,741,119中所描述。在共同擁有并共同待決的美國專利申請公開US20090246846A1中公開了通過以來自突變的高活性運動發酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子(Pgap)進行的大腸桿菌木糖異構酶表達而改善木糖利用的工程改造。依然需要對于在木糖利用中具有進一步改善的發酵單胞菌屬菌株和其它細菌乙醇菌原。專利技術概述本專利技術提供了表達高活性木糖異構酶的重組木糖利用型發酵單胞菌屬或發酵桿菌屬(Zymobacter)細胞，其提供了改善的木糖利用和乙醇生產。因此，本專利技術提供了選自發酵單胞菌屬和發酵桿菌屬的重組細菌菌株，其包含編碼具有木糖異構酶活性的多肽的異源核酸分子，其中所述多肽是組I木糖異構酶且被包括在標識為EC5.3.1.5的酶的分類中，并且所述菌株利用木糖作為碳源。可用于本專利技術的木糖異構酶是當使用利用SEQIDNO：2、24、32、34、42、54、66、68、78、96、100、106、108、122、126、128、130、132、135、137和142準備的序型隱蔽馬爾科夫模型(ProfileHiddenMarkovModel)查詢時，給出1E-15或更低的E值得分的酶；所述查詢使用hmmsearch算法進行，其中Z參數設定為10億。或是基于使用GAPPENALTY＝10、GAPLENGTHPENALTY＝0.1、以及Gonnet250系列的蛋白質權重矩陣的默認參數的ClustalW比對方法，與選自SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146和147的氨基酸序列具有至少90％的同一性的酶。或當與SEQIDNO：66的參照氨基酸序列比較時具有以下保守氨基酸或以下保守氨基酸的90％的酶：a)在位置226處的亮氨酸，b)在位置223處的甲硫氨酸，c)在位置191處的異亮氨酸，d)在位置195處的蘇氨酸、絲氨酸或纈氨酸，e)在位置88處的甲硫氨酸、蘇氨酸或quaninef)在位置290處的組氨酸，g)在位置221處的谷氨酸或天冬氨酸，h)在位置242處的苯丙氨酸、纈氨酸或亮氨酸，i)在位置243處的組氨酸，j)在位置193處的亮氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸，k)在位置256處的谷氨酰胺，l)在位置213處的甘氨酸，m)在位置288處的脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸或絲氨酸，和n)在位置249處的谷氨酰胺。在另一個實施方案中，本專利技術提供了改善重組細菌細胞中木糖利用的方法，其包括：a)提供選自發酵單胞菌屬和發酵桿菌屬的重組細菌菌株，所述重組細菌菌株包含木糖利用途徑，包含不屬于組I的木糖異構酶；以及b)導入編碼具有木糖異構酶活性的多肽的異源核酸分子，其中所述多肽是組I木糖異構酶。或者，本專利技術提供了生產乙醇的方法，其包括：a)提供本專利技術的重組細菌菌株；以及b)在所述菌株生產乙醇的條件下，使(a)的菌株與木糖接觸。附圖說明和序列描述圖1示出了進行木糖利用工程改造的發酵單胞菌屬的乙醇發酵途徑的示意圖。圖2是木糖異構酶的系統發育樹的示意圖，其顯示了組I和組II分支。圖3是組I木糖異構酶的系統發育樹的示意圖。圖4是ZW641對照菌株和使用具有表達來自密蘇里游動放線菌(A.missourinesis)(355-1、355-2)、短乳桿菌(L.brevis)(356-1、356-2)或大腸桿菌(357-1、357-2)的木糖異構酶的密碼子優化編碼區的基因進行轉化的ZW641菌株的生長曲線圖。圖5是ZW641對照菌株和使用具有表達來自密蘇里游動放線菌(355-1)、短乳桿菌(356-2)或大腸桿菌(357-2)的木糖異構酶的密碼子優化編碼區的基因進行轉化的ZW641菌株的木糖異構酶活性圖，其通過半胱氨酸-咔唑法進行測量。圖6是ZW641對照菌株和使用具有表達來自密蘇里游動放線菌(AMxylA)、大腸桿菌(ECxylA)、昏暗地嗜皮菌(Geodermatophilusobscurus)(GOxylA)、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)(MSxylA)、Salinisporaarenicola(SAxylA)或Xylanimonascellulosilytica(XCxylA)的木糖異構酶的密碼子優化編碼區的基因進行轉化的ZW641菌株的生長曲線圖。圖7是ZW641對照菌株和使用具有表達來自密蘇里游動放線菌(AMxylA)、大腸桿菌(ECxylA)、昏暗地嗜皮菌(GOxylA)、恥垢分枝桿菌(MSxylA)、Salinisporaarenicola(SAxy本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.06.29 US 61/3594631.選自發酵單胞菌屬(Zymomonas)和發酵桿菌屬(Zymobacter)的重組細菌菌株，其中所述菌株包含木酮糖激酶、轉酮醇酶和轉醛醇酶，并且進一步包含SEQIDNO:308所示的異源核酸分子，其中所述菌株利用木糖作為碳源，并且其中所述重組細菌菌株產生的乙醇量超過不包含所述異源核酸分子的對應的親本菌株產生的乙醇量的3.5倍。2.改善重組細菌細胞中木糖...

【專利技術屬性】
技術研發人員：RY卡塞，M齊，L陶，PV維塔寧，J楊，
申請(專利權)人：納幕爾杜邦公司，
類型：
國別省市：