豬TGEV抗體與豬PEDV抗體膠體金試紙條制造技術

本發明專利技術公開了一種快速檢測PEDV和TGEV血清抗體的試紙條及其制備方法。本發明專利技術試紙條的基本結構為支撐層、加樣層、金標蛋白釋放墊、檢測層與吸收層；該試紙條的金標蛋白與檢測線蛋白為通過原核高效表達系統獲得的豬流行性腹瀉病毒的S1蛋白與豬傳染性胃腸炎病毒的包含S蛋白AD位點的重組蛋白，其兩條質控線蛋白分別為針對兩種蛋白的單克隆抗體。與傳統的PEDV與TGEV抗體檢測試紙條相比，本發明專利技術的試紙條特異性強，安全性高，操作簡單，判定結果快捷。

【技術實現步驟摘要】
豬TGEV抗體與豬PEDV抗體膠體金試紙條
本專利技術屬于獸醫生物
，涉及一種快速檢測抗體技術，尤其涉及豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）兩種抗體的膠體金檢測試紙條，同時還涉及該試紙條的制備方法和應用方法。
技術介紹
豬傳染性胃腸炎(TransmissibleGastroenteritis,TGE)和豬流行性腹瀉(PorcineTransmissibleGastroenteritis,PED)是由冠狀病毒科、冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒(TransmissibleGastroenteritisvirusTGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PorcineTransmissibleGastroenteritisvirus,PEDV)引起的豬的高度接觸性腸道疾病,以秋始、冬春加劇和夏少為主要流行特點，各種年齡豬都可發病,哺乳仔豬病死率很高,10日齡以內仔豬病死率可達100%。近年來，豬腹瀉病給我國養豬業帶來巨大損失。為了更好的控制這兩種豬腹瀉疾病，就必須及時了解并掌握豬場病毒的感染情況，因此，開發建立一種可以對豬群同時進行PEDV和TGEV血清抗體檢測快速的有效方法是十分必要的。目前已有的檢測血清抗體的方法主要有酶聯免疫吸附法（ELISA法）和中和試驗法，在這些傳統的檢測方法中存在一些較難克服的缺點，比如：中和試驗步驟較為繁瑣，檢測所需時間較長，且結果判定需要一定的專業技術；ELISA檢測法中需要配合酶標儀進行使用，檢測的專業人員也需要經過專業培訓，同時ELISA檢測方法還存在特異性不高穩定性差等特點。因此迫切的需要建立一種省時省力又可以迅速普及的檢測方法。免疫膠體金技術目前已廣泛應用于臨床診斷，在專利技術“檢測一種或多種豬病毒性腹瀉疾病抗體的試紙條”中就結合免疫膠體金技術進行檢測。其金標蛋白為SPA蛋白或待檢抗體，檢測線固定TGEV與PEDV全病毒，質控線為羊或兔抗SPA產生的IgG蛋白或者羊或兔抗TGEV和PEDV病毒的IgG蛋白。使用全病毒與SPA存在靈敏度不高、特異性不強的特點，如果使用病毒中強抗原性蛋白與其單克隆抗體那么久可以解決其靈敏度與特異性的問題。
技術實現思路
本專利技術的一個目的在于提供一種快速檢測PEDV和TGEV血清抗體的試紙條。本專利技術的另一個目的在于提供該試紙條的制備方法。本專利技術試紙條包括支撐層，以及在所述支撐層上依次設置的加樣墊、金標蛋白釋放墊、檢測層和吸收層，其中，所述金標蛋白釋放墊包埋有膠體金標記的兩種表達蛋白，分別是豬流行性腹瀉病毒S1蛋白與含有豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白AD位點的重組表達蛋白片段；所述檢測層上設置有兩條檢測線和兩條質控線，所述兩條檢測線依次固定所述的S1蛋白及所述的S蛋白AD位點的重組表達蛋白片段，所述兩條質控線依次固定有針對兩個蛋白片段的單克隆抗體。其中，支撐層優選選用聚乙烯纖維板；加樣墊優選選用中速定性濾紙；釋放墊優選選用玻璃纖維；檢測層優選選用硝酸纖維素膜；吸收層優選選用玻璃纖維。本專利技術提供的所述檢測試紙條的制備方法包括以下步驟：1）在檢測層的不同位置上分別固定豬流行性腹瀉病毒S1蛋白與豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的AD位點重組表達蛋白片段及其對應的單克隆抗體，分別形成兩條檢測線和質控線；2）制備含有兩種金標蛋白的釋放墊；3）組裝支撐層、加樣墊、金標蛋白釋放墊、檢測層和吸收層。1）在檢測層的不同位置上依次固定豬流行性腹瀉病毒其中，制備金標蛋白釋放墊包括如下步驟：以1:100~3000的標記比例將待標記的豬流行性腹瀉病毒S1蛋白或豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白AD位點的重組表達蛋白片段加入到pH7.0~10.0膠體金溶液中，按1:10~500的比例用含0.1~5%BSA的0.001~0.1mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋膠體金標記的S1蛋白或S蛋白AD位點的重組表達蛋白，將稀釋后的膠體金標記蛋白液按60μL/cm2的速度噴于玻璃纖維素膜中，4℃低溫真空干燥。其中，將包被濃度為0.1~2mg/mL，優選為0.2~0.8mg/mL的豬流行性腹瀉病毒S1蛋白按1μL/cm的速度噴于檢測層上作為檢測線1，將包被濃度為0.1~2mg/mL，優選為0.2~0.8mg/mL的豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白AD位點的重組表達蛋白按1μL/cm的速度噴于檢測層上作為檢測線2，將包被濃度為0.1~5mg/mL，優選為0.2~0.8mg/mL的豬流行性腹瀉病毒S1蛋白單克隆抗體按1μL/cm的速度噴于檢測線下方的檢測層上作為質控線1，將包被濃度為0.1~5mg/mL，優選為0.2~0.8mg/mL的豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白AD位點的重組表達蛋白單克隆抗體按1μL/cm的速度噴于質控線1下方的檢測層上作為質控線2，37℃下干燥30min，從而制備檢測層。本專利技術中使用的金標蛋白和檢測線蛋白均為豬流行性腹瀉病毒S1蛋白與含有豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白AD位點的重組表達蛋白，質控線蛋白則為兩種蛋白各自的單克隆抗體，解決了靈敏度與特異性問題，建立起省時省力又能迅速普及的檢測方法。與傳統的PEDV與TGEV抗體檢測方法相比，本專利技術具有明顯的優越性：1）特異性強，使用原核表達的PEDVS1蛋白與TGEVS蛋白AD位點的重組表達蛋白和其相應的單克隆抗體，極大的降低了出現假陽性的概率，保證了試紙條特異性和靈敏度，同時，兩條質控線也保證了檢測結果的準確性；2）安全性高，避免檢測過程中病毒的操作；3）操作簡便，本專利技術不需要專業的技術人員進行操作和專業儀器的輔助檢測；4）判定結果快捷，與傳統的中和試驗和ELISA試驗所用時間相比，本檢測結果直觀易判定并且檢測時間只需10min極為迅速。附圖說明圖1所示為本專利技術試紙條側面結構示意圖。圖中：1為加樣墊，2為釋放墊，3為檢測層，4為吸收層，5為支撐層，6為檢測線-1，7為檢測線-2，8為質控線-1，9為質控線-2。圖2所示是本專利技術金試紙條正面結構示意圖。圖中：A檢測線-1、2與質控線-1、2均顯現，為PEDV和TGEV抗體陽性樣品檢測結果；B檢測線-1與兩條質控線均顯色，其為PEDV抗體陽性樣品檢測結果；C檢測線-2與兩條質控線均顯色，其為TGEV抗體陽性樣品檢測結果；D僅有一條質控線顯色，為無效檢測；E質控線與檢測線均不顯現，為無效檢測。具體實施方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。實施例1PEDVS1蛋白的表達純化及其單克隆抗體的制備1、PEDVS1蛋白的表達純化①目的基因的提取與擴增本膠體金試紙條選擇的金標蛋白為PEDVS蛋白中反應原性較好的片段S1蛋白，針對國內流行株，根據其對應的S1蛋白基因設計如下引物上游引物：5’-ACGGATCCGATGGCACCAGGTGATC-3’下游引物：5’-CTGAATTCATGACTGTCCATGACTC-3’使用試劑盒（ROCHE試劑盒）提取豬流行性腹瀉病毒的RNA。具體操作步驟：在1.5mL的EP管中加入200μL病毒液和400μL含有PolyA的BindingBuffer，混勻靜置1min后轉移入高效過濾管中，8000×g離心15s棄去液體；加入過濾管中500μLInhibitorRemovalBuffer8000×g離心1min，棄去液體；加入過濾管中450μLWashBuffer80本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種豬流行性腹瀉病毒抗體與豬傳染性胃腸炎病毒抗體膠體金快速檢測試紙條，包括支撐層，以及在所述支撐層上依次設置的加樣墊、金標蛋白釋放墊、檢測層和吸收層，其特征在于，所述金標蛋白釋放墊包埋有膠體金標記的兩種表達蛋白，分別是豬流行性腹瀉病毒S1蛋白與豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的AD位點重組表達蛋白；所述檢測層上設置有兩條檢測線和兩條質控線，所述兩條檢測線依次固定所述的S1蛋白及所述的S蛋白的AD位點重組表達蛋白片段，所述兩條質控線依次固定有針對兩個蛋白片段的單克隆抗體。

【技術特征摘要】
1.一種豬流行性腹瀉病毒抗體與豬傳染性胃腸炎病毒抗體膠體金快速檢測試紙條，包括支撐層，以及在所述支撐層上依次設置的加樣墊、金標蛋白釋放墊、檢測層和吸收層，其特征在于，所述金標蛋白釋放墊包埋有膠體金標記的兩種重組表達蛋白，分別是豬流行性腹瀉病毒S1蛋白與豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的AD位點重組表達蛋白；所述檢測層上設置有兩條檢測線和兩條質控線，所述兩條檢測線依次固定所述的S1蛋白及所述的S蛋白的AD位點重組表達蛋白片段，所述兩條質控線依次固定有針對兩個蛋白片段的單克隆抗體，其中，將包被濃度為1mg/mL的豬流行性腹瀉病毒S1蛋白按1μL/cm的速度噴于檢測層上作為檢測線1，將包被濃度為0.5mg/mL的豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的AD位點重組表達蛋白按1μL/cm的速度噴于檢測層上作為檢測線2，將包被濃度為1mg/mL的豬流行性腹瀉病毒S1蛋白單克隆抗體按1μL/cm的速度噴于檢測線下方的檢測層上作為質控線1，將包被濃度為0.5mg/mL的豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的AD位點重組表達蛋白單克隆抗體按1μL/cm的速度噴于質控線1下方的檢測層上作為質控線2，37℃下干燥30min，從而制備檢測層。2.如權利要求1所述的試紙條，其特征在于，支撐層選用聚乙烯纖維板；加樣墊選用中速定性濾紙；釋放墊選用玻璃纖維；檢測層選用硝酸纖維素膜；吸收層選用玻璃纖維。3.權利要求1或2所述的試紙條的制備方法，其包括如下步驟：1）在檢測層的不同位置上分別...

【專利技術屬性】
技術研發人員：于倩倩，王貴華，于萍萍，侯艷紅，陳翠云，趙亞榮，
申請(專利權)人：北京大北農科技集團股份有限公司動物醫學研究中心，北京大北農科技集團股份有限公司，北京科牧豐生物制藥有限公司，福州大北農生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：