本發明專利技術公開了一種固體菌劑及其制備方法和應用。所述固體菌劑的制備方法包括：(1)將未滅菌的玉米芯靜置培養，獲得培養物A；(2)在所述培養物A中接入黑曲霉(Aspergillus?niger)和麥曲；混合培養，獲得所述固體菌劑。本發明專利技術還提供了一種利用所述制備方法獲得的固體菌劑及其在生產纖維素復合酶系中的應用。與現有技術相比，本發明專利技術利用未滅菌載體上的天然菌群對產酶微生物進行馴化，獲得的固體菌劑不僅微生態穩定，而且能夠對纖維基質進行糖化發酵生產纖維素復合酶系，可實現對纖維基質低成本高性價比的轉化。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及纖維質廢棄物利用領域，尤其涉及一種固體菌劑及其制備方法和應用。
技術介紹
飼料是發展畜牧業的物質基礎，而大量的多纖維粗飼料又是世界上一筆取之不盡、用之不竭的飼料資源。纖維質粗飼料資源包括農作物的秸桿、皮、殼、芯、廢棄木材、鋸末等，據統計，全世界每年的農作物秸桿產量約40多億噸，我國每年約有7 8億噸。這些資源粗纖維含量高， 蛋白質少，粗灰分多，適口性差，不適于直接作飼料，長期以來大都被燒掉或者部分還田，而作為飼料利用的尚不到五分之一，資源利用率低而污染嚴重。玉米芯屬木質纖維素類生物質原料之一，在自然界的纖維質廢棄物中占有很大比例。玉米芯結構復雜而成分單一，主要是纖維素、半纖維素和木質素，含有豐富碳源，但由于纖維素、半纖維素和木質素的緊密纏繞使其成為慢利用碳源。多年來，許多國家致力于研究多種方法對纖維質粗飼料進行加工處理，包括化學、 物理、生物學方法在內，使其轉化成適口性良好、營養價值高的飼料。其中，最有前景的是微生物發酵法，該方法既不需要太復雜的設備和過多的能量消耗，又不需高溫、高壓、強酸、強堿等較為極端的條件。微生物發酵法是通過微生物對纖維質粗飼料進行充分發酵利用生產纖維素酶添加劑，用于提高飼料利用率，改善飼料的營養價值，降低飼料成本，提高經濟效益，具有廣闊的開發前景。目前國內普遍使用的固體菌劑有兩種純化的單一菌劑和簡單混合菌劑。純化的單一菌劑是在自然環境中篩選優良的產酶單菌株，再通過一定的誘變手段，獲得工業化大規模生產的產酶菌株，再吸附到特定載體上制成的菌劑。但自然環境中對纖維素、木質素等成分的降解是多種微生物協同完成的，微生物之間相互協調、相互制約，使產生的水解酶之間的比例處于一種最適降解狀態。而純化的單一菌劑中的菌種由于失去了自然條件下長期處于協同關系的其他菌的共存，其產酶能力大大降低，所產纖維素復合酶系往往不全，對發酵條件要求較高，且易受污染。簡單混合菌劑是將兩種或兩種以上的產酶菌種按一定的比例混合，吸附于適宜的載體上制成。人為地簡單混合，各種菌之間是否具有協同關系，是否產生拮抗作用還有待證實。
技術實現思路
·本專利技術提供了一種固體菌劑的制備方法，該方法操作簡便，獲得的固體菌劑微生態穩定。一種固體菌劑的制備方法，包括(I)將自然選取的玉米芯靜置培養，獲得培養物A ;(2)在所述培養物A中接入黑曲霉(Aspergillus niger)和麥曲；混合培養，獲得所述固體菌劑。本專利技術利用在自然選取的玉米芯上自然生長的天然菌群對接入的產酶微生物進行馴化，獲得了一種微生態穩定的固體菌劑。為利于微生物的生長繁殖，所述玉米芯粉碎成I 2_片段后再進行靜置培養。如無特殊說明，本專利技術中的玉米芯均為被無菌粉碎成I 2_的片段。步驟(I)中，所述靜置培養的溫度優選為28 32°C，培養時間優選為20 30小時。合理的培養溫度使玉米芯上的天然菌群能自然生長，合理的培養時間使所述天然菌群不會因生長過盛而影響產酶微生物的生長。本專利技術可選用黑曲霉(Aspergillus niger)ZJU-RYD1,為浙江大學食品科學與發酵工程研究所保藏。也可選用其他可發酵生產纖維素復合酶系中的一種或多種酶的黑曲霉 (Aspergillus niger)。所述黑曲霉(Aspergillus niger)優選經活化后配制成1X108 109spores/mL 的孢子懸液再進行接種；接種量為8 12mL/100g玉米芯。所述麥曲與玉米芯的重量比優選為4 6 : 100。優選地,所述麥曲為生麥曲，由安吉烏氈帽酒廠提供。與熟麥曲相比，生麥曲中微生物種類較為豐富，能夠分泌更多更豐富的酶類。步驟(2)中，所述混合培養的溫度為29 31 °C，培養環境濕度控制在90 100 %， 培養時間為45 50小時。本專利技術還提供了利用所述制備方法制得的固體菌劑。所述固體菌劑微生態穩定、 能對纖維基質進行糖化發酵產生纖維素復合酶系，利用這種微生態群系可以進行較為粗放的發酵，不必擔心污染問題，實現對纖維基質的低成本高性價比生物轉化。本專利技術還提供了所述固體菌劑在生產纖維素復合酶系中的應用，包括將玉米芯、蘋果皮、麥麩、水混合，接入所述固體菌劑，攪拌均勻，靜置培養，獲得所述纖維素復合酶系。將該纖維素復合酶系與適宜的載體混合，還可制成纖維素酶制劑，用作飼料添加劑，提高飼料利用率，改善飼料品質。玉米芯、蘋果皮、麥麩、水優選以重量比O. 8 1. 2 O. 8 1. 2 O. 4 0.6 2. 3 2. 7混合。所述固體菌劑的添加量優選為8 12%。所述靜置發酵的條件優選為發酵溫度為28 31°C，發酵環境濕度控制在86 94%,發酵時間為3 6天。發酵基質的厚度控制在2 3cm,以增加透氣率,促進微生物生長。發酵完成后，將發酵物與適量的緩沖液混合，進行酶液的提取。所述緩沖液優選為O. 5M的檸檬酸酸鈉溶液(pH 4. 8)，與發酵物以6 8 I (v/ w)的比例混合，30°C水浴55 65min后離心，上清液即為所`需酶液。與現有技術相比，本專利技術的有益效果為本專利技術利用自然選取的載體上的天然菌群對產酶微生物進行馴化，獲得的固體菌劑不僅微生態穩定，而且能夠對纖維基質進行糖化發酵生產纖維素復合酶系，可實現對纖維基質低成本高性價比的轉化。具體實施方式I菌劑的制備(I)玉米芯天然菌群的制備將野外采集的玉米芯基質(采自浙大紫金港)無菌粉碎成片段為l_2mm的玉米芯，取IOOg玉米芯于30°C培養24小時，獲得培養物A。如無特殊說明，本專利技術中的玉米芯均指片段為l_2mm的玉米芯。(2)黑曲霉活化本具體實施方式選用黑曲霉(Aspergillus niger)ZJU-RYDl，為浙江大學食品科學與發酵工程研究所保藏；生麥曲由安吉烏氈帽酒廠提供。將黑曲霉ZJU-RYDl接種到PDA培養基斜面，28°C條件下培養3 4d進行活化。獲取活化后的黑曲霉ZJU-RYDl的孢子，用蒸餾水制成濃度為I X 108SpOreS/mL的孢子懸液， 備用。(3)固體菌劑的制備往步驟(I)獲得的培養物A中接入IOmL黑曲霉ZJU-RYDl孢子懸液、5g生麥曲，混合后于30°C培養48 60小時，即獲得固體菌劑。2固態發酵下面以玉米芯作發酵底物為例，舉例說明本專利技術固體菌劑在制備纖維素復合酶系中的應用。取玉米芯，與麥麩、蘋果皮、水以1:1 : O. 5 : 2. 5的比例混合，接種10% (w/w) 的固體菌劑。發酵基質厚度控制在2cm左右，30°C培養，濕度保持在90%以上，發酵5天。3酶液提取和酶活測定(I)酶液提取將發酵產物和O. 5M的檸檬酸酸鈉緩沖液(pH 4. 8)按比例(w/v = 1:7)混合， 放入30°C水浴60min，然后在室溫下3000rpm離心取上清液，即得所需酶液。(2)酶活測定I)纖維素酶(內切葡聚糖酶)活性測定將一張Sigma濾紙剪成l*3cm于試管中，加O. 5M的檸檬鈉緩沖液(pH5. 8) IOmL,加酶液O. 5mL, 50°C保溫lOmin。加入3mL DNS試劑，沸水浴加熱5min，冷卻至室溫后加蒸餾水定容至25mL，測定還原糖量。一個酶活單位(U)定義 為每分鐘水解濾紙產生I μ mo I葡萄糖所需的酶量。2)木聚糖酶活性測定底物選擇以O.本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種固體菌劑的制備方法，其特征在于，包括：(1)將自然選取的玉米芯靜置培養，獲得培養物A；(2)在所述培養物A中接入黑曲霉(Aspergillus?niger)和麥曲；混合培養，獲得所述固體菌劑。
【技術特征摘要】
1.一種固體菌劑的制備方法，其特征在于，包括 (1)將自然選取的玉米芯靜置培養，獲得培養物A; (2)在所述培養物A中接入黑曲霉(Aspergillusniger)和麥曲；混合培養，獲得所述固體菌劑。2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述玉米芯粉碎成I 2_片段后再進行靜置培養。3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述靜置培養的溫度為28 32°C，時間為20 30小時。4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述黑曲霉(Aspergillusniger)經活化后配制成IX IO8 109spores/mL的孢子懸液再進行接種；接種量為8 12mL/100g玉米芯。5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所...
【專利技術屬性】
技術研發人員：阮暉，杜姍姍，伍星主，何李琳，李青青，徐娟，陳功，諸文穎，楊璐，劉松柏，何國慶，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：
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