在重組畢赤酵母中高效表達(dá)抗菌肽NZ2114的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種在重組畢赤酵母中高效表達(dá)抗菌肽NZ2114的方法，通過(guò)構(gòu)建含有經(jīng)過(guò)酵母偏愛(ài)密碼子優(yōu)化編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得的重組畢赤酵母經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)，分泌產(chǎn)生抗菌肽NZ2114。本發(fā)明專利技術(shù)通過(guò)優(yōu)化抗菌肽NZ2114基因序列，構(gòu)建特異表達(dá)載體，首次實(shí)現(xiàn)了抗菌肽NZ2114在畢赤酵母中的高效表達(dá)，產(chǎn)量突破克級(jí)水平，克服了大規(guī)模生產(chǎn)中產(chǎn)量過(guò)低或化學(xué)合成成本過(guò)高的問(wèn)題，并建立完善的純化體系，可實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，可應(yīng)用于抗菌藥物開(kāi)發(fā)，飼料添加劑開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種在重組畢赤酵母中高效表達(dá)抗菌肽NZ2114的方法。
技術(shù)介紹
抗菌肽(AMP)是生物體內(nèi)具有生物活性的小分子多肽，主要特點(diǎn)如下抗菌活性高，抗菌譜廣，種類多，而且對(duì)真菌，原蟲(chóng)乃至病毒和腫瘤細(xì)胞都有殺傷或抑制作用(Brandenburg, Merres et al. 2012)。由于其突出的生物學(xué)特性,最有潛力作為型新安全無(wú)害抗生素替代品，從而備受科學(xué)界關(guān)注(Eckert 2011; Brandenburg, Merres等,2012)。Plectasin是2005年由Mygid等人從來(lái)源于北歐松林地表腐生子囊菌(Pseudoplectania nigrella)中分離得到一種具有抗菌功能的抗菌肽,也是首例真菌防御素。Plectasin基因開(kāi)放閱讀框編碼一個(gè)95個(gè)殘基長(zhǎng)的前體肽，由一個(gè)信號(hào)肽序列(殘基1-23)，一個(gè)前片斷(殘基23-55)和一個(gè)40個(gè)殘基的C端區(qū)域的成熟多肽(殘基56-95)，與幾種無(wú)脊椎動(dòng)物防御素存在50-55%序列相似性。Plectasin成熟多肽由40個(gè)AA組成，含有6個(gè)Cys殘基和5個(gè)Iys殘基，一個(gè)區(qū)別的四肽(DEDD)模式，分子量為4，398. 80Da，凈電荷在+ I到+ 3之間變化，主要取決于它的兩個(gè)組氨酸的離子狀態(tài)。其6個(gè)Cys在分子內(nèi)形成3對(duì)二硫鍵(Cys4_Cys30，Cysl5-Cys37, Cysl9_Cys39)，二級(jí)結(jié)構(gòu)由三對(duì)二硫鍵穩(wěn)定的一個(gè)N端的a-螺旋和C端的兩個(gè)反向平行的￠-折疊結(jié)構(gòu)以及螺旋和折疊結(jié)構(gòu)之間的Loop 區(qū)組成(Mygind, Fischer 等，2005)。NZ2114是新型的抗菌肽,屬`于真菌防御素Plectasin的突變體。D. Ravent6s等(2005)基于提高該真菌防御素對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌的抗菌活性，通過(guò)高通量突變篩選到一個(gè)對(duì)金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)烈抑菌活性的突變體(Raventos，Taboureau等，2005)。Brinch(2010)等對(duì)NZ2114胞內(nèi)和胞外殺菌活性做了綜合研究，結(jié)果顯示，NZ2114對(duì)MRSA、VRSA、MSSA具有較強(qiáng)的胞內(nèi)和胞外殺菌活性，與達(dá)托霉素相當(dāng)，而胞內(nèi)殺菌活性甚至優(yōu)于萬(wàn)古霉素(Brinch, Tulkens等,2010)。D. Andes等(2009)對(duì)14株金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌(包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA和耐青霉素的肺炎鏈球菌FRSP)，結(jié)果顯示NZ2114的MIC相對(duì)于本體防御素增加30倍之多(0. 06 u g/ml 2. 0 u g/ml) (Andes, Craig等，2009)，進(jìn)而通過(guò)小鼠感染模型對(duì)其藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行相關(guān)研究，結(jié)果顯示，皮下注射30min后小鼠血液中NZ2114濃度達(dá)到峰值，其藥物半衰期為0. 38到1. 0h，同時(shí)對(duì)NZ2114的蛋白結(jié)合率進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明NZ2114蛋白結(jié)合率為80%(Andes，Craig等，2009)。D.Andes等(2009)還對(duì)NZ2114抗生素后效應(yīng)(PAE)參數(shù)進(jìn)行研究，其對(duì)感染肺炎鏈球菌(S. pneumoniae strain ATCC 10813, MIC, 0. 06mg/ml))小鼠注射單劑量為 10、40 和 60mg/kg 后其 PAE 分別為 2. 3,4. 5,7. 7h,而 NZ2114 對(duì)金黃色葡萄球菌(S. aureus strain ATCC25923，MIC,1. 0mg/ml)的PAE分別為1. 2、2. 6、4. 6h。而且相關(guān)研究表明，NZ2114以高于MIC單劑量處理的金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌在12 15h內(nèi)停止用藥，病原菌不會(huì)出現(xiàn)反彈。金黃色葡萄球菌是世界范圍內(nèi)流行的易感病原菌，容易引起人敗血癥，表皮及軟組織感染，肺炎等疾病(Diekema, Pfaller等,2001)。隨著人類抗生素大量頻繁使用，加上金黃色葡萄球菌自身易獲得耐藥性，大量MRSA菌株不斷在臨床或社區(qū)發(fā)現(xiàn)，以致形成了兩大類型醫(yī)院獲得型 MRSA (HA-MRSA)和社區(qū)感染型 MRSA (CA-MRSA) (Rountree and Freeman1955;Chambers and DeLeo 2009;Elston, Meigh 等，2009;Skov and Jensen 2009;Eckert2011)，對(duì)人類健康造成巨大威脅。研究開(kāi)發(fā)新型殺滅金黃色葡萄球菌的抗生素替代品對(duì)于預(yù)防和治療由金黃色葡萄球菌，特別是MRSA引起中疾病具有重要意義。抗菌肽替代傳統(tǒng)抗生素應(yīng)用于由細(xì)菌感染所引起的各種疾病一直備受科學(xué)界關(guān)注，也是人類對(duì)抗各種病原菌的有效武器。抗菌肽抗菌譜過(guò)寬，穩(wěn)定性不好，具有細(xì)胞毒性，抗菌活性不足，用藥多樣性，生產(chǎn)成本高(基因克隆表達(dá)產(chǎn)量太低和化學(xué)合成成本過(guò)高)等一直是抗菌肽應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)(Eckert 2011)。抗菌肽NZ2114具有抗菌譜窄，不具有細(xì)胞毒性，抗菌活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。目前，關(guān)于抗菌肽NZ2114相關(guān)研究中使用的NZ2114均為化學(xué)合成(Andes, Craig 等，2009; Brinch, Tulkens 等，2010; Xiong, Hady 等，2011),且未見(jiàn)有關(guān)其基因克隆表達(dá)方面的研究報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種在重組畢赤酵母中高效表達(dá)抗菌肽NZ2114的方法。為了實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)的一種含有編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列的表達(dá)載體，包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、位 于啟動(dòng)子下游的編碼a-因子分泌信號(hào)肽的核苷酸序列以及編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列，所述編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表達(dá)產(chǎn)物切割識(shí)別序列AAGAGA。已知抗菌肽NZ2114 (菌絲霉素衍生物)的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。前述的表達(dá)載體，其中所述編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列是按照酵母所偏愛(ài)的密碼子進(jìn)行優(yōu)化的序列，具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。前述的表達(dá)載體，出發(fā)載體優(yōu)選為pPICZ a A。前述的表達(dá)載體，在編碼a -因子分泌信號(hào)肽的核苷酸序列的5’端連接有XhoI酶切位點(diǎn)，且在XhoI酶切位點(diǎn)的5’端連接有保護(hù)堿基CCG ;在編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列的3’端連接有XhaI酶切位點(diǎn)，且在XhaI酶切位點(diǎn)的3’端連接有保護(hù)堿基GC。本專利技術(shù)還提供含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為畢赤酵母，更優(yōu)選為畢赤酵母X-33基因工程菌。本專利技術(shù)還提供一種重組巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)X_33/NZ2114,現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏日期2012年12月13日，保藏號(hào)CGMCC No. 6987。本專利技術(shù)還提供培養(yǎng)上述畢赤酵母X-33基因工程菌的方法，包括以下步驟I)種子液的制備從YPD平板挑取酵母轉(zhuǎn)化子單菌落，接種于含IOOii g/mlzeocin的IOml YH)液體培養(yǎng)基中，29 °C，250rmp，搖床培養(yǎng)18_24h，以1%接種量接種于200ml YPD液體培養(yǎng)基中，29°C，250rmp，搖床培養(yǎng)16_18h，至OD6tltol值為6，本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種含有編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列的表達(dá)載體，其特征在于，包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、位于啟動(dòng)子下游的編碼α?因子分泌信號(hào)肽的核苷酸序列以及編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列，所述編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表達(dá)產(chǎn)物切割識(shí)別序列AAGAGA。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種含有編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列的表達(dá)載體，其特征在于，包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、位于啟動(dòng)子下游的編碼α -因子分泌信號(hào)肽的核苷酸序列以及編碼抗菌肽ΝΖ2114的 DNA序列，所述編碼抗菌肽ΝΖ2114的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表達(dá)產(chǎn)物切割識(shí)別序列AAGAGA。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列如 SEQ ID No. 2 所示。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體的出發(fā)載體為 pPICZa A04.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，在編碼a-因子分泌信號(hào)肽的核苷酸序列的5’端連接有XhoI酶切位點(diǎn)，且在XhoI酶切位點(diǎn)的5’端連接有保護(hù)堿基CCG ;在編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列的3’端連接有XhaI酶切位點(diǎn)，且在XhaI酶切位點(diǎn)的3’端連接有保護(hù)堿基GC。5.含有權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其為畢赤酵母。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其為畢赤酵母X-33基因工程菌。8.權(quán)利要求7所述基因工程菌的培養(yǎng)方法，包括以下步驟1)種子液的制備從YPD平板挑取酵母轉(zhuǎn)化子單菌落,接種于含100yg/mlzeocin的 IOml YPD液體培養(yǎng)基中，290C，250rmp，搖床培養(yǎng)18_24h，以1%接種量接種于200ml YPD液體培...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王建華，張勇，滕達(dá)，王秀敏，毛若雨，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：