一種共表達(dá)UPR關(guān)鍵基因和下游靶基因增強(qiáng)葡萄糖氧化酶分泌的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種共表達(dá)UPR關(guān)鍵基因和下游靶基因增強(qiáng)分泌表達(dá)葡萄糖氧化酶的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)采用基因重組技術(shù)將畢赤酵母UPR關(guān)鍵基因Haclp與下游靶基因Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1分別克隆連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα與pPIC3.5K，并轉(zhuǎn)化入Pichia?pastoris?GS115-pPIC9K-GOD保藏編號為CCTCC?NO：M?2012266的菌株中，經(jīng)篩選鑒定得到一株較原有菌株增強(qiáng)分泌表達(dá)葡萄糖氧化酶的菌株。該菌株表達(dá)的葡萄糖氧化酶在3L發(fā)酵罐上酶活585U/mL。這為葡萄糖氧化酶的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

一種共表達(dá)UPR關(guān)鍵基因和下游靶基因增強(qiáng)分泌表達(dá)葡萄糖氧化酶的方法，屬于基因工程

技術(shù)介紹
葡萄糖氧化酶是生物領(lǐng)域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面，將其應(yīng)用于血糖測定以來，GOD被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等許多相關(guān)領(lǐng)域。在食品工業(yè)中，由于氧的存在，引起許多不利于產(chǎn)品質(zhì)量的化學(xué)反應(yīng)，并為許多微生物生長創(chuàng)造了條件。目前，許多國家已將GOD作為工人的安全抗氧劑而廣泛應(yīng)用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化氫、形成葡萄糖酸四個方面。利用其專一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析儀，能快速準(zhǔn)確簡易地測定各種食品中的葡萄糖含量，指導(dǎo)生產(chǎn)。在醫(yī)藥工業(yè)中，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清(漿)、尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；G0D制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成防止口腔疾病和牙病的發(fā)生。此外，由于可以催化生成H2O2，還可用于對H2O2敏感的淋巴瘤的導(dǎo)向目標(biāo)的治療。GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)飼糧消化，促進(jìn)動物生長。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預(yù)防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進(jìn)動物生長作用。從動植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細(xì)菌GOD產(chǎn)酶量少；一般采用具有GRAS資格的黑曲霉和青霉屬菌株作為GOD生產(chǎn)菌。我國及美國均采用點青霉及產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)G0D,日本常用尼崎青霉,俄羅斯用生機(jī)青霉,近年報道膠霉屬Clioctadium、擬青霉屬Paecilomyces和帚霉屬Scopulariopsis也能生產(chǎn)G0D。但產(chǎn)量低、酶活低、檢測方法復(fù)雜是GOD產(chǎn)業(yè)化的限制性因素，國內(nèi)外為此做了大量工作并取得了明顯進(jìn)展。目前國外生產(chǎn)的GOD廠家主要是德國的Boehringer和日本的Τ0Υ0Β0。規(guī)?；a(chǎn)高活性的GOD還有困難。發(fā)酵生產(chǎn)GOD的同時產(chǎn)生大量雜蛋白，分離提取復(fù)雜，成本高。利用基因工程或發(fā)酵工程來研究GOD的過量表達(dá)。其酶學(xué)性質(zhì)、分子改造最終為實現(xiàn)葡萄糖氧化酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)和策略導(dǎo)向。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供了一種共表達(dá)UPR關(guān)鍵基因和下游靶基因增強(qiáng)分泌表達(dá)葡萄糖氧化酶的方法。技術(shù)方案為將畢赤酵母UPR關(guān)鍵基因Haclp連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ α，下游靶基因Pdil、EroU LhsU Kar2、Sill (其中Pdil、Kar2為畢赤酵母來源基因，EroULhsU Sill為釀酒酵母來源基因)連接到表達(dá)載體pPIC3. 5K，并將下游靶基因表達(dá)質(zhì)粒分別同 Haclp 表達(dá)質(zhì)粒一起將轉(zhuǎn)化入 Pichia pastorisGS 115-pPIC9K_G0D。所述Haclp、PdiU Kar2 為畢赤 GS115 來源基因，所述 Erol、LhsU Sill 為Saccharomycescerevisiae S288c 來源基因。具體步驟如下I)設(shè)計引物以畢赤酵母和釀酒酵母反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板擴(kuò)增出Haclp、Pdil、Erol、Lhsl、Kar2、Sill 基因；2 )將Hac Ip基因連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ α，下游靶基因Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sill (其中Pdil、Kar2為畢赤酵母來源基因，Erol、Lhsl、Sill為釀酒酵母來源基因)連接到表達(dá)載體 PPIC3. 5K，得到重組質(zhì)粒 pPICZ-Hacl，pPIC3. 5K_Pdil，pPIC3. 5K_Erol, pP IC3. 5K-Lhsl, pPIC3. 5K_Ka2, pPIC3. 5K_Sill ；3)將步驟 2)中重組載體 pPICZ-Hacl 分別與 pPIC3. 5K_Pdil、pPIC3. 5K_Erol、pPIC3. 5K-Lhsl、 pPIC3.5K-Kar2、 pPIC3. 5K-Sill 轉(zhuǎn)化入 Pichia pastorisGS115-pPIC9K-G0D得到五株分泌增強(qiáng)型基因工程菌。所述引物如下Hac-F :5’ -AGTTCGAAATGCCCGTAGATTCTTCTC-3，Hac-R 5，~AAATATGCGGCCGCCTATTCCTGGAAGAATACAAAGTC~3，Pd1-F :5’ -CGGGATCCATGCAATTCAACTGGGATATTAAAACTGTG-3>Pd1-R 5，-AAATATGCGGCCGCTTAAAGCTCGTCGTGAGCGTC-3，Ero-F :5，-CGGGATCCATGAGATTAAGAACCGCCAT-3， Ero-R 5，~AAATATGCGGCCGCTTATTGTATATCTAGCTTAT~3，Lhs-F :5’ ~CGGGATCCATGCGAAACGTTTTAAGGCTTTT~3JLhs-R :5’ -AAATATGCGGCCGCCTATAATTCATCATGCAAAATGTCT-3>Kar-F :5’ ~CGGGATCCATGCTGTCGTTAAAACCATCTT~3JKar-R :5’ ~AAATATGCGGCCGCTATCTACAACTCATCATGAT~3JSil-F :5，-CGGGATCCATGGTCCGGATTCTTCCCAT-3>Si1-R :5’ -AAATATGCGGCCGCTCAGAGTTCATCTCTGAAATTT-3，PCR反應(yīng)體系0. 2mL PCR管中按順序加入以下試劑10XLAPCR buffer II(Mg2+plus) 5 μ I; DNTP Mixture 8 μ I ;模板 DNA I μ I ;上下游引物各 2 μ I ；Taq 酶 0· 5 μ I ;加雙蒸水至終體積為50 μ I。PCR 擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，57°C退火 90s，72°C延伸 3min (30個循環(huán))；72°C延伸IOmin。用限制性內(nèi)切酶BspT104 I和Not I雙酶切消化純化后的Haclp基因和載體pPICZ α，用限制性內(nèi)切酶SnaB I和Not I雙酶切消化純化后的PdiU EroU LhsU Kar2、Sill基因和載體pPIC3. 5K，并分別連接，得到重組載體pPICZ-Hacl，pPIC3. 5K_Pdil，pPIC3 5K-Erol, pPIC3. 5K_Lhsl, pPIC3. 5K-Kar2, pPIC3. 5K_Sill，將 pPIC3. 5K_Pdil, pPIC3. 5K-Erol, pPIC3. 5K-Lhsl, pPIC3. 5K_Kar2, pPIC3. 5K_Sill 分別同 pPICZ-Hacl 一起轉(zhuǎn)化 PichiapastorisGS115-pPIC9K-G0D，經(jīng)篩選鑒定獲得重組菌 Pichia pastorisGS115-pPIC9K_G0D/pPICZ-Hacl/pPIC3. 5K_Pdil (pPIC3. 5K-Erol, pPIC3. 5K_Lhsl, pPIC3. 5K-Kar2, pPIC3. 5K—Sill)。葡萄糖氧化酶酶活測定方法G0D活性測定一般采用鄰本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種共表達(dá)UPR關(guān)鍵基因和下游靶基因增強(qiáng)葡萄糖氧化酶分泌的方法，其特征在于，是將畢赤酵母UPR關(guān)鍵基因Haclp連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα上，將其下游靶基因連接到表達(dá)載體pPIC3.5K上，并將下游靶基因表達(dá)質(zhì)粒與Haclp表達(dá)質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)化入Pichia?pastoris?GS115?pPIC9K?GOD中得到的基因工程菌。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳堅，顧磊，張娟，堵國成，沈伊娜，聞一凡，李夢潔，李婷，丁雪，
申請(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：