本發明專利技術提供了一種新型的共表達源自宇佐美曲霉(Aspergillus?usamii)E001阿魏酸酯酶A基因和β-1，4-木聚糖酶基因的工程菌GS115/faeA-xyn11A的構建方法。所構建成的畢赤酵母共表達系統可用于的阿魏酸酯酶和β-1，4-木聚糖酶的工業化生產。所制備的兩種酶具有底物親和力強、催化效率高的特性，具有較大的工業化生產潛力和經濟價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種共表達源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的阿魏酸酯酶A成熟肽基因(faeA)和β_1，4_木聚糖酶基因(xynllA)的畢赤酵母新表達系統，屬于生物工程
技術介紹
半纖維素是自然界的第二大類多糖聚合物，作為木質素和纖維素中間的連接物， 廣泛存在于植物細胞壁。半纖維素的降解產物具有廣泛的應用價值，因此，如何充分利用豐富的半纖維素資源成為研究的熱點。已有報道表明，阿魏酸酯酶可以和其它的半纖維素酶 (如木聚糖酶)協同作用使微生物對植物細胞壁中半纖維素進行最大程度的降解。阿魏酸酯酶(E. C. 3.1.1. 73,ferulic acid esterase,FAE)又稱肉桂酸酯酶,是羧酸水解酶的一個亞類，屬于胞外酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來。自1991年Faulds等首次分離出阿魏酸酯酶以來，已有超過30種阿魏酸酯酶被純化，其主要生物功能是水解植物細胞壁中多糖與阿魏酸連結的酯鍵，釋放出游離的單體阿魏酸或阿魏酸二聚體。β-1，4_內切木聚糖酶(EC 3. 2.1. 8, endo-β-1,4-xylanase) 是一類能夠專一降解木聚糖為 低聚木糖和木糖的一組酶的總稱，主要從主鏈內部作用于木糖苷鍵，是木聚糖降解過程中最重要的酶之一。能夠產生木聚糖酶的微生物有很多，包括絲狀真菌、細菌、放線菌等。兩種酶均廣泛應用于食品、醫藥、飼料、造紙和印染等領域。在食品工業中可利用阿魏酸酯酶打斷阿魏酸與細胞壁材料如麩皮、秸桿中多糖的交聯，高效降解多糖并獲得反式阿魏酸，它和阿拉伯木聚糖酶聯合作用的水解產物低聚糖 (主要是低聚木糖)、阿魏酸都是重要的功能性食品基料，戊糖可用于酒精發酵、生產木糖醇等。在飼料工業中，利用阿魏酸酯酶處理植物性的原材料，可以將阿魏酸從植物細胞壁的結構中游離出來，從而破壞細胞壁的骨架結構，使得木質素、半纖維素及纖維素之間的連接被部分打破，結構變得比處理前疏松，變得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用，可以提高飼料的利用效率。早期對于阿魏酸酯酶和β -1,4-內切木聚糖酶的研究多集中在產酶菌株的選育、 發酵條件的優化、酶的分離純化、酶的理化性質、酶的復合誘變、酶的水解機理等方面。隨著分子生物學研究的不斷深入與完善，越來越多的工作集中于酶的基因克隆和高效表達方面，如構建和篩選優良的高效基因工程菌株；基于酶結構與功能的關系，通過定點誘變改變酶活性位點，從而實現催化功能的改變，以拓寬其應用范圍等。不同來源的兩種酶基因已經被克隆，并在大腸桿菌、釀酒酵母、畢氏酵母等表達系統中進行了表達。然而在畢赤酵母系統中進行共表達的研究尚未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是構建一種新型的共表達阿魏酸酯酶A和β -1，4-木聚糖酶基因的畢赤酵母工程菌。本專利技術的技術方案所設計到的pPICZ a A-faeA和pPIC9k_xynllA均為本實驗室構建和保藏。所述的重組FaeA和重組XynlIA活性的測定方法以阿魏酸甲酯(MFA)為底物，高效液相(HPLC)分析阿魏酸的釋放量。具體操作按為移取900 μ L MFAdmM, pH 6.0)于2mL EP管中，45°C保溫lOmin，加入100 μ L適當稀釋的酶液，反應IOmin后加入400 μ L冰乙酸終止反應，立即混勻進行高效液相分析。以先在酶溶液中加入400 μ L冰乙酸，再加底物溶液為對照。色譜條件以甲醇、I %乙酸一步梯度洗脫，在IOmin內，甲醇濃度由50%上升至80% ,流速lmL/min,柱溫30°C,檢測波長320nm, 上樣量20 μ L。根據峰面積，從標準曲線查出相應的阿魏酸量，從而計算酶活。酶活單位定義在測定條件下(45°C、pH 6. O)每分鐘產生I μ mo I阿魏酸所需的酶量為一個酶活單位 ⑶。于25mL具塞試管A和B中，各加入質量濃度為O. 5%的底物溶液2. 4mL, 50°C預熱IOmin,在A管中加入O.1mL適當稀釋的酶液,50°C反應IOmin ;立即各加入2. 5mL 3', 5' — 二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加O.1mL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從標準曲線上查出相應的木糖含量并折算成酶活性單位。重組XynllA活性測定底物為用pH 4. 6、檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制的樺木木聚糖(Sigma，USA)溶液。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分鐘產生I μ mol還原糖所需的酶量定義為I個木聚糖酶活性單位(IU)。所述的重組工程菌的構建方法(l)GS115/faeA的構建、表達及活性測定用Sac I對pPICZ a A-faeA進行線性化， 按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化GSl 15感受態細胞，用Zeocin篩選得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/faeA ;按照手冊上的標準流程進行誘導表達，以阿魏酸甲酯為底物，高 效液相法分析阿魏酸的釋放量，測得發酵液中重組阿魏酸酯酶的酶活性。(2)工程菌65115八^么17111認的構建用Sal I對pPIC9k_xynllA進行線性化， 按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化GS115/faeA感受態細胞，用G418篩選得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/faeA-XynllA ;按照手冊上的標準流程進行誘導表達，分別用HPLC法和DNS法測定重組阿魏酸酯酶和重組木聚糖酶的酶活性。本專利技術的有益效果本專利技術提供了一種新型的共表達阿魏酸酯酶基因和β-1， 4-木聚糖酶基因的工程菌GS115/faeA-XynllA的構建方法。本專利技術不僅實現了對雙質粒體系在共表達的應用進行了有益探索，而且實現了目標酶的共同生產，降低了產物的制備成本，為進一步工業化生產復合酶奠定了基礎。具體實施方式以下結合具體實施例，進一步闡述本專利技術的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本專利技術，而不用于限制本專利技術的范圍。實施例1工程菌GS115/faeA的構建、表達及產物活性測定用Sac I對pPICZ a A-faeA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化GS115 感受態細胞，用Zeocin篩選得到高拷貝的畢赤酵母重組子GSl 15/man5A。該工程菌用1. 0% 甲醇誘導72h，以阿魏酸甲酯為底物，HPLC分析阿魏酸釋放量，測定發酵液中重組阿魏酸酯酶活性達7. 04U/mL。SDS-PAGE電泳顯示重組甘露聚糖酶分子量為36. OkDa。實施例2工程菌GS115/faeA-XynllA的構建、表達及產物活性測定用Sal I對pPIC9k-XynllA進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化 GSl 15/faeA感受態細胞，用G418篩選得到高拷貝的畢赤酵母重組子GSl 15/man5A_xynl 1A。 該工程菌用1. 0%甲醇誘導72h，DNS法測得發酵液中重組木聚糖酶活性達600IU/mL，重組阿魏酸酯酶活性仍為7. 04U/mL。SDS-PAGE電泳顯示重組木聚 糖酶和阿魏酸酯酶分子量分別為 20. 7kDa 和 36. OkDa。權利要求1.一種共表達源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E00本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種共表達源自宇佐美曲霉(Aspergillus?usamii)E001的阿魏酸酯酶A成熟肽基因(faeA)和β?1，4?木聚糖酶基因(xyn11A)的畢赤酵母新表達系統。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄔敏辰，龔燕燕，殷欣，曾妍，李劍芳，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
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