本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種在hp4d啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下在解脂耶羅維亞酵母中制備蛋白質(zhì)、優(yōu)選外源蛋白質(zhì)的方法。具體而言，本發(fā)明專利技術(shù)描述了一種通過調(diào)節(jié)碳的供應(yīng)和/或氮的供應(yīng)而調(diào)節(jié)解脂耶羅維亞酵母的生長速率的方法。發(fā)現(xiàn)生長速率小于0.045h″l對于增加解脂耶羅維亞酵母生物質(zhì)和增加所生產(chǎn)的感興趣的外源蛋白質(zhì)的量而言是最優(yōu)的。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】—種在解脂耶羅維亞酵母中制備多肽的方法
技術(shù)介紹
本專利技術(shù)涉及一種在解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia Iipolytica)中制備多肽的方法。特別地，本專利技術(shù)涉及一種通過操控酵母的生長條件并由此操控所述酵母的生長過程，對使用hp4d啟動(dòng)子在解脂耶羅維亞酵母(Y. Iipolytica)中表達(dá)感興趣的多肽進(jìn)行優(yōu)化的方法。解脂耶羅維亞酵母是一種用于生產(chǎn)檸檬酸的非常規(guī)酵母，其已被美國食品和藥物管理局(American Food and Drug Administration, FDA)確定為公認(rèn)安全(GRAS)狀態(tài)(Fickers et al.，2005)。許多分子工具均可用于外源蛋白質(zhì)在解脂耶羅維亞酵母中的表達(dá)，因?yàn)樵摻湍妇哂懈叩姆置谀芰Α６嗫截悗лd體(Multi-copy vector)含有ura3d4標(biāo)記，其在多拷貝互補(bǔ)中是需要的，以允許對帶多個(gè)插入的轉(zhuǎn)化株進(jìn)行篩選(Madzak et al. , 2004)。所述ura3d4篩選標(biāo)記確保對帶10 - 13個(gè)完整表達(dá)盒(integrated cassette)拷貝的轉(zhuǎn)化株的篩選(Juretzek et al.，2001)。所述hp4d啟動(dòng)子是用于在解脂耶羅維亞酵母中表達(dá)外源多肽的最常用的啟動(dòng)子(Madzak et al.，2004)。該啟動(dòng)子由XPR2啟動(dòng)子的上游激活序列I的四個(gè)串聯(lián)重復(fù)拷貝組成，并且其表達(dá)不受環(huán)境條件的顯著影響。但是，其調(diào)節(jié)作用是未知的，并且據(jù)報(bào)道其對蛋白質(zhì)的生產(chǎn)是半組成型(quasi constitutive)的,且調(diào)節(jié)作用僅發(fā)生在早期生長穩(wěn)定期中。因此需要對hp4d啟動(dòng)子獲得更多的理解，以確定該啟動(dòng)子是否可用于操控并最終增加蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
根據(jù)本專利技術(shù)，提供了一種在解脂耶羅維亞酵母中表達(dá)多肽的方法，該方法包括步驟使解脂耶羅維亞酵母發(fā)酵，該酵母已經(jīng)多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述多核苷酸在hp4d啟動(dòng)子的控制下編碼多肽；和在發(fā)酵期間將解脂耶羅維亞酵母的生長速率限制為低于0. 0451!'所述生長速率可以限制為約Ο. ^βΙΓ1至約O.CMOh—1，更優(yōu)選約Ο. ^δΙΓ1至約0. 0391^。甚至更優(yōu)選，所述生長速率可以限制為約0. 0351!'所述生長速率可以通過控制加入至含解脂耶羅維亞酵母的發(fā)酵溶液中的食物源(例如碳源和/或氮源)的量進(jìn)行限制。所述碳源可為葡萄糖，所述氮源可為酵母提取物。所述多肽可為蛋白質(zhì)，例如酶，如脂肪酶或甘露聚糖酶。所述發(fā)酵可為分批發(fā)酵法、分批進(jìn)料發(fā)酵法、反復(fù)分批進(jìn)料發(fā)酵法或連續(xù)發(fā)酵法。優(yōu)選地，所述方法增加了多肽產(chǎn)量，相比于生長速率不受限制的對照組解脂耶羅維亞酵母。在本專利技術(shù)的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在上述方法中使用的轉(zhuǎn)化了多核苷酸的解脂耶羅維亞酵母，所述多核苷酸在hp4d啟動(dòng)子的控制下編碼多肽。在本專利技術(shù)的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種含有用于實(shí)施上述方法的解脂耶羅維亞酵母的試劑盒(kit)。附圖說明圖I :顯示了葡萄糖峰值對穩(wěn)定解脂耶羅維亞酵母Polf 413-5發(fā)酵的p02、殘余葡萄糖和生物質(zhì)濃度的影響。圖2 :顯示了稀釋速率對在穩(wěn)定連續(xù)發(fā)酵中的解脂耶羅維亞酵母Polf413_5的生物質(zhì)、殘余葡萄糖和酶體積活性(volumetric enzyme activity)的影響。圖3 :顯示了稀釋速率對在穩(wěn)定連續(xù)發(fā)酵中通過解脂耶羅維亞酵母Polf413_5生產(chǎn)脂肪酶的響應(yīng)程度的影響。生長速率如數(shù)據(jù)記錄單中所給出的。 圖4 :顯示了稀釋速率對在穩(wěn)定連續(xù)發(fā)酵中通過解脂耶羅維亞酵母Polf413_5生產(chǎn)脂肪酶的體積速率和比速率的影響。圖5 :顯示了在二次分批發(fā)酵中的解脂耶羅維亞酵母Polf 413-5的生長情況。圖6 :顯示了在二次分批發(fā)酵中通過解脂耶羅維亞酵母Polf 413-5生產(chǎn)脂肪酶。圖7 :顯不了指數(shù)全培養(yǎng)基進(jìn)料(exponential full medium feed)對解脂耶羅維亞酵母Polf413-5的生長的影響。全培養(yǎng)基以O(shè). 0291Γ1 (開符)和O. 0411Γ1 (閉符)的指數(shù)進(jìn)料速率進(jìn)料。圖8 :顯示了指數(shù)全培養(yǎng)基進(jìn)料對通過解脂耶羅維亞酵母Polf 413-5生產(chǎn)脂肪酶的影響。全培養(yǎng)基以O(shè). 0291Γ1 (開符)和O. 0411Γ1 (閉符)的指數(shù)進(jìn)料速率進(jìn)料。圖9 :顯示了指數(shù)全培養(yǎng)基進(jìn)料對通過解脂耶羅維亞酵母Polf 413-5對生產(chǎn)脂肪酶的速率影響。全培養(yǎng)基以O(shè). 0291Γ1 (開符)和O. 0411Γ1 (閉符)的指數(shù)進(jìn)料速率進(jìn)料。圖10 :顯示了在二次分批發(fā)酵中Y. Iipolytica ManA:HmA(Roth等，2009)的生長情況。圖11 :顯不了指數(shù)全培養(yǎng)基進(jìn)料對Y. Iipolytica ManA:HmA的生長的影響。全培養(yǎng)基以O(shè). 0351Γ1 (開符)和O. 045h^ (閉符)的指數(shù)進(jìn)料速率進(jìn)料。圖12 :顯示了指數(shù)全培養(yǎng)基進(jìn)料對通過Y lipolytica ManA:HmA生產(chǎn)甘露聚糖酶的影響。全培養(yǎng)基以O(shè). 0351Γ1 (開符)和O. 045h^ (閉符)的指數(shù)進(jìn)料速率進(jìn)料。圖13 :顯示了指數(shù)全培養(yǎng)基進(jìn)料對通過Y lipolytica ManA:HmA生產(chǎn)甘露聚糖酶的速率的影響。全培養(yǎng)基以O(shè). 0351Γ1 (開符)和O. 045h^ (閉符)的指數(shù)進(jìn)料速率進(jìn)料。具體實(shí)施例方式現(xiàn)將在下文參照附圖對本專利技術(shù)進(jìn)行更充分描述，其中僅說明了本專利技術(shù)的幾個(gè)但不是所有的實(shí)施方案。本專利技術(shù)公開了一種在解脂耶羅維亞酵母中表達(dá)多肽的方法，其中使解脂耶羅維亞酵母發(fā)酵，所述酵母經(jīng)多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述多核苷酸在hp4d啟動(dòng)子的控制下編碼多肽，并在發(fā)酵期間限制解脂耶羅維亞酵母的生長速率低于O. 045h-1o所述生長速率可限制為約O. 023h^至約O. (MOtT1，更優(yōu)選約O. 035^'至約O. 0391Γ1。例如，所述生長速率可限制為約 O. 023,0. 024,0. 027,0. 029,0. 035 或 O. 0391Γ1。所述生長速率可通過控制加入至發(fā)酵溶液中的碳源、氮源和/或其他源例如葡萄糖或酵母提取物的量進(jìn)行限制。所述發(fā)酵可為分批發(fā)酵法、分批進(jìn)料發(fā)酵法或連續(xù)發(fā)酵法。所述多肽可為外源或同源的多肽、蛋白質(zhì)或酶。在下述實(shí)施例中，使用脂肪酶和甘露聚糖酶作為通過解脂耶羅維亞酵母表達(dá)的示例酶。在半組成型的hp4d啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下通過解脂耶羅維亞酵母進(jìn)行的酶的生產(chǎn)始于生長穩(wěn)定期開始時(shí)。使用在葡萄糖受限制條件下的連續(xù)發(fā)酵來確定生長速率對在hp4d啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下生產(chǎn)的脂肪酶的影響。Lip2基因，其在解脂耶羅維亞酵母中編碼細(xì)胞外的脂肪酶和來自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatu)的內(nèi)切-I, 4_β-D-甘露聚糖酶(β-甘露聚糖酶)在半組成型的hp4d啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下用多拷貝LIP2表達(dá)框在Y lipolytica Polf中進(jìn)行過表達(dá)(MatA，Leu2·-207, ura3-302, xpr2-322, axp-2)。生產(chǎn)的最大脂肪酶體積活性13014nkat. ml—1是在生長速率為O. 024h^時(shí)，該速率為估算的最低生長速率。但是，脂肪酶生產(chǎn)的最大速率在生長速率大于O. 0351^時(shí)得到。脂肪酶生產(chǎn)的臨界生長速率在O. 0351Γ1和O. 0391Γ1之間本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：彼得勒斯·雅各布斯·范澤爾，
申請(專利權(quán))人：CSIR公司，
類型：
國別省市：
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