一種利用糖化酶篩選高產檸檬酸菌株的方法技術

本發明專利技術涉及一種利用糖化酶在篩選高產檸檬酸菌種中的方法。包括通過測定檸檬酸發酵過程中糖化酶和檸檬酸含量，篩選糖化酶含量高的檸檬酸高產菌株。本發明專利技術方法篩選的發酵菌株性能穩定，發酵前期產糖較快，檸檬酸積累速度較快，尤其突出表現為發酵終點發酵殘糖低，殘總糖在1.0%以下。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微生物領域，具體地，涉及。
技術介紹
在我國的朽1檬酸行業中，利用淀粉質原料，以黑曲霉(Aspergillusniger)為菌種深層發酵生產檸檬酸的水平已達到世界先進水平。其生產工藝為先將淀粉質原料粉碎、力口α -淀粉酶將淀粉液化分解為短鏈的糊精，取其液化液加適量有機氮源進行發酵，發酵醪液經過提取后獲得檸檬酸。黑曲霉可以自身分泌糖化酶，并且該糖化酶可以耐受酸性環境。黑曲霉利用糖化酶對短鏈的糊精進行分解獲得葡萄糖，葡萄糖進入EMP途徑，經三羧酸循環獲得檸檬酸。檸檬酸菌種進行生產篩選時的主要指標是搖瓶產酸。其篩選流程為平板分離后，單菌落接入試管，將成熟的孢子接入搖瓶培養基中，在96小時檢測搖瓶產酸，選取搖瓶高產酸的編號試管進行傳代用于發酵生產。在檸檬酸發酵生產中經常發 現，當應用不同批次菌種時，會出現產酸及殘糖的區另O。排除發酵過程中通氣、攪拌罐壓等控制因素的影響，研究發現，不同批次菌種篩選結果中，每一只試管斜面接種培養基后，其糖化酶的活力不同。當淀粉質原料經α-淀粉酶液化后，糖化酶活力強的試管菌株產生的發酵菌球可以快速的分泌糖化酶，從而將短鏈糊精較快的分解為葡萄糖供給菌體進行發酵產酸。而分泌糖化酶慢或糖化酶活力較弱的菌株，將短鏈糊精分解為葡萄糖的速度較慢，這會導致檸檬酸發酵產酸速度較慢。當檸檬酸一旦積累，發酵醪液的PH值迅速下降。如果糖化酶的耐酸性較弱，分解短鏈糊精的速度將大為下降，到發酵終點時，發酵醪液中殘糖較高不能被利用。因此，在發酵開始后，檸檬酸產生菌黑曲霉的糖化酶的活力是影響檸檬酸產酸速率與發酵殘糖的重要因素。
技術實現思路
為解決上述技術問題，本專利技術目的是提供。為實現本專利技術的目的，本專利技術的主要技術路線如下:通過測定檸檬酸發酵過程中糖化酶和朽1檬酸含量，篩選朽1檬酸高產菌株。具體地，通過測定24小時、36小時的發酵醪液中的糖化酶含量和測定96小時的發酵醪液中的檸檬酸含量來篩選糖化酶與檸檬酸產生量高的檸檬酸高產菌株。上述技術方案具體包括以下步驟:(I)將黑曲霉孢子接入檸檬酸發酵搖瓶中，發酵培養；(2)將24小時、36小時發酵醪液中菌絲體過濾，測定濾清液中糖化酶含量；(3)將96小時發酵醪液中菌絲體過濾，測定濾清液中檸檬酸含量；(4)篩選糖化酶與檸檬酸產生量高的檸檬酸高產菌株。其中，篩選糖化酶含量高的檸檬酸高產菌株的標準為糖化酶含量:24小時酶活力大于2500u/100ml、36小時酶活力大于1800u/100ml。篩選朽1檬酸含量高的朽1檬酸高產菌株的標準為:96小時朽1檬酸的含量大于15g/100ml。優選地，24小時酶活力 2500-2800u/100ml、36 小時酶活力 1800-2000u/100ml。篩選朽1檬酸含量高的朽1檬酸高產菌株的標準為:96小時朽1檬酸的含量15-16g/100ml。其中，步驟(1)中黑曲霉孢子的發酵培養為常規方法培養。黑曲霉菌株包括各種不同來源的黑曲霉菌株。發酵培養基的配方例子為:所述的培養基為玉米粉按22%的質量百分比用自來水配制；在IL發酵培養基中加α -淀粉酶0.Γ0.5mL,由水浴鍋控制液化溫度，分段液化(65°C保溫45min，然后升溫至90°C后保溫，直至終點)，以碘液不變色為液化終點。過濾后得液化清液。其中，所述玉米液化液中含糖量15 16%。發酵培養基中加入總重量1(Γ14%的玉米蛋白粉為有機氮源。培養條件的例子為:發酵條件為溫度36-39°C，搖瓶轉速為350-400r/min，培養時間 96h。本專利技術的積極效果在于:本專利技術中所述方法進行檸檬酸菌株的篩選，發酵菌株性能穩定，發酵前期產糖較快，檸檬酸積累速度較快，尤其突出表現為發酵終點發酵殘糖低，殘總糖在1.0%以下。具體實施例方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。在不背離本專利技術精神和實質的情況下，對本專利技術方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本專利技術的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。黑曲霉菌株(ATCC16404)購自廣東省微生物研究所。實施例1菌種分離用接種環取一環成熟孢子于裝有無菌水及玻璃珠的三角瓶中，置于搖瓶機上震蕩5分鐘，使孢子懸浮于水中。取已滅菌的裝有9mL無菌水試管數支，做好標號，另用無菌吸管吸取菌懸液lmL，注入I號試管，充分搖勻，使孢子均勻地懸浮在無菌水中。吸取此懸浮液ImL注入2號試管中，依次類推，直至最后一支試管。每稀釋一管，必須更換一支無菌吸管。從最后2 3支試管中分別用無菌吸管吸取0.1mL放入無菌平板中，每個梯度做31塊平板。對滴加孢子懸液的平板利用無菌刮棒進行涂布。將涂布后平板包好置培養箱中37°C培養40小時，選取菌絲白色、表面突起、邊緣整齊、菌落較小、皺褶較深、孢子穗大而稀疏的黑曲霉菌落進入試管斜面。對不同菌落進行編號，分別為1#、2#、3#。實施例21#菌種搖瓶篩選情況1.搖瓶發酵培養基的制備將玉米粉按22%的粉漿比調漿，加入0.Γ0.5mL/L α -淀粉酶，由水浴鍋控制液化溫度，分段液化(65°C保溫45min，然后升溫至90°C后保溫，直至終點)，以碘液不變色為液化終點(液化液含糖量為15-16%)，過濾后得液化清液，加入總重量1(Γ14%的玉米蛋白粉的有機氮源。2.接種培養條件:搖瓶培養基121°C滅菌30min，冷卻后備用。在凈化臺上按無菌操作每只搖瓶接入一環黑曲霉孢子。接種后搖瓶置搖床上，轉速為400rpm/min, 39°C培養96hr,離心后測酸。3、檢測結果發酵周期在24、36小時時，將發酵瓶從搖瓶機上取下，將發酵醪液用濾紙過濾，取濾液進行糖化酶酶活的測定。發酵96小時后，將發酵瓶從搖瓶機上取下，將發酵醪液用濾紙過濾，取濾液Iml用0.1429mol/L的氫氧化鈉溶液滴定終點(以酚酞為指示劑)。1#試管斜面菌種搖瓶篩選見表1，以3次結果的平均值計量。表11#試管斜面菌種搖瓶篩選結果本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用糖化酶篩選高產檸檬酸菌株的方法：其特征在于，通過測定檸檬酸發酵過程中糖化酶和檸檬酸含量，篩選檸檬酸高產菌株。

【技術特征摘要】
1.一種利用糖化酶篩選高產檸檬酸菌株的方法:其特征在于，通過測定檸檬酸發酵過程中糖化酶和朽1檬酸含量，篩選朽1檬酸高產菌株。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，測定24小時、36小時的發酵醪液中的糖化酶含量。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，測定96小時的發酵醪液中的檸檬酸含量。4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，具體包括以下步驟: (1)將黑曲霉孢子接入檸檬酸發酵搖瓶中，發酵培養； (2)將24小時、36小時發酵醪液中菌絲體過濾，測定濾清液中糖化酶含量； (3)將96小時發酵醪液中菌絲體過濾，測定濾清液中檸檬酸含量； (4)篩選糖化酶與朽1檬...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李榮杰，尚海濤，楊為華，鄧遠德，穆曉玲，李維理，
申請(專利權)人：安徽豐原發酵技術工程研究有限公司，
類型：發明
國別省市：