一種產喜樹堿的喜樹內生真菌及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種產喜樹堿的喜樹內生真菌及其在制備喜樹堿中的應用。深綠木霉LY357是從珙桐科植物喜樹器官組織中分離得到的內生真菌，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2012年11月19日，保藏編號CGMCC6858。該菌株采用常規的液體發酵培養方法可應用于制備喜樹堿，所得喜樹堿主要存在于發酵液提取物中。深綠木霉LY357從喜樹植物材料中分離獲取的方法簡單易操作，利用深綠木霉LY357發酵培養獲得喜樹堿的方法簡單易操作，并且所得喜樹堿產量較高。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種內生真菌及其應用，特別是涉及一種喜樹內生真菌及其在制備喜樹堿中的應用，屬于微生物真菌及由其制造或獲得的物質

技術介紹
喜樹堿(CPT)屬于萜類吲哚生物堿，是一種通過抑制拓撲異構酶I而發揮抗腫瘤活性的天然化合物，其抗腫瘤機制獨特。喜樹堿系列衍生物如10-羥基喜樹堿、伊立替康、拓撲替康等是附加值極高的抗腫瘤藥物，對多種器官組織的癌癥病變均有效，已成為世界抗腫瘤藥物市場上的主要品種。喜樹堿最早由Wall等人于1966年從我國特有珙桐科植物喜樹(Camptotheca acuminata)樹皮中分離獲得，后來又陸續在海木狗牙花(Ervatamiaheyneana)、臭味假柴龍樹(Nothapodytesfoetida)以及短小蛇根草(Ophiorrhizapumila)等植物中發現。喜樹堿市場需求大，單純靠從喜樹中提取喜樹堿已無法滿足人們的需求(國際市場每年喜樹堿需求量3000kg，但是全球喜樹堿年產量僅600kg)，同時也會造成資源的浪費和環境的破壞。因此，開展喜樹內生真菌的分離及其代謝產物的研究，利用微生物發酵技術合成喜樹堿，提高喜樹堿產量成為喜樹堿獲取的重要途徑。
技術實現思路
本專利技術的目的就是提供一種喜樹內生真菌菌株及其在喜樹堿制備中的應用方法。該菌株從喜樹植物材料中分離獲取，通過發酵培養能夠獲得喜樹堿，且產量較高。為實現上述目的，本專利技術提供一種從珙桐科植物喜樹中分離得到內生真菌LY357，屬深綠木霉(Trichoderma atroviride),已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2012年11月19日，保藏編號CGMCC6858。從喜樹中分離得到內生真菌LY357的ITS和5.8S rDNA堿基序列如SEQ ID N0.1所示為:TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA測序結果SEQ ID N0.1 遞交 http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast 進行比對,根據BLAST結果并結合形態學特征得出結論，確證該菌株為深綠木霉，命名為深綠木霉LY357 (Trichoderma atroviride LY357)。一種從喜樹中分離深綠木霉LY357的方法:將喜樹植物材料按照常規操作切段、清洗、消毒后接種到5%水瓊脂固體培養基，28 °C ±2°C恒溫培養2 3周，待植物材料長出菌絲，挑取菌絲移至沙氏瓊脂固體培養基繼續培養，最后經純化后得到內生真菌深綠木霉LY357。按照接種的一般操作方法，經切段、清洗、消毒的喜樹植物材料在接種前先切斷，并將新切面接種到5%水瓊脂固體培養基。上述深綠木霉LY357采用常規的液體發酵培養方法可應用于制備喜樹堿。一種利用深綠木霉LY357獲得喜樹堿的方法，包括深綠木霉LY357菌株發酵培養步驟、喜樹堿提取步驟；其特征在于:在所述發酵培養步驟中，將深綠木霉LY357菌株接種到沙氏瓊脂液體培養基，搖床160 土 20rpm，28 ± 2°C，發酵培養8 15d，得到發酵混合物；在所述喜樹堿提取步驟中，將發酵混合物經4000rpm離心15min，過濾，分別收集濾液與菌絲體；所述濾液經氯仿-甲醇(V/V=4:1)混合溶劑萃取，有機相于40°C減壓濃縮至干得到發酵液提取物；所述菌絲體研磨破碎，甲醇浸泡過夜，等體積氯仿-甲醇(V/V=4:1)混合溶劑萃取，有機相40°C減壓濃縮得到菌絲體提取物；發酵液提取物或菌絲體提取物加入氯仿-甲醇(V/V=4:1)溶解，經針頭過濾器過濾得到喜樹堿粗提物。上述獲得喜樹堿的方法，依照常規操作必要時需要先制備種子液，包括菌種活化與種子培養。菌種活化中，活化培養基為沙氏固體培養基，28±2°C,培養時間5 7d ;種子培養中，培養基為沙氏液體培養基，28 ± 2°C，搖床160 土 20rpm培養2 3d。深綠木霉LY357經發酵培養制得的發酵液提取物或菌絲體提取物的成分分析顯示，喜樹堿主要存在于發酵液提取物中，菌絲體提取物中僅含有痕量喜樹堿。與現有技術相比，本專利技術的有益效果是:(I)從喜樹植物中分離出新的喜樹內生真菌深綠木霉LY357 ; (2)深綠木霉LY357具有產喜樹堿特性，能夠應用于制備喜樹堿；(3)深綠木霉LY357經發酵培養具備較高的喜樹堿產量(見表I); (4)深綠木霉LY357分離方法簡單易控制；(5)利用深綠木霉LY357獲得喜樹堿的方法簡單易控制。 表I深綠木霉LY357與現有產喜樹堿株菌產量的比較本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種從珙桐科植物喜樹中分離得到內生真菌LY357，屬深綠木霉，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2012年11月19日，保藏編號CGMCC6858。

【技術特征摘要】
1.一種從珙桐科植物喜樹中分離得到內生真菌LY357，屬深綠木霉，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2012年11月19日，保藏編號CGMCC6858。2.根據權利要求1所述的內生真菌，其特征在于:ITS和5.8S rDNA片段608bp JBSEQID N0.1 所示。3.根據權利要求1所述的內生真菌應用于制備喜樹堿。4.一種從珙桐科植物喜樹中分離得到內生真菌深綠木霉LY357的方法，其特征在于:將喜樹植物材料按照常規操作切段、清洗、消毒后接種到5%水瓊脂固體培養基，28°C ±2°C恒溫培養2 3周，待植物材料長出菌絲，挑取菌絲移至沙氏瓊脂固體培養基繼續培養，最后經純化后得到內生真菌深綠木霉LY357。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述喜樹植物材料是喜樹樹根或樹皮或果實或樹葉或樹枝。6.一種利用珙桐科植物喜樹內生真菌深綠木霉LY357獲得喜樹堿的方法，包括深綠木霉LY357菌株發酵培養步驟、喜樹堿粗提物步驟；其特征在于: 在所述發酵培養步驟中，依常規方法制得深綠木霉LY35...

【專利技術屬性】
技術研發人員：羅應剛，蒲祥，屈細興，陳菲，張國林，
申請(專利權)人：中國科學院成都生物研究所，
類型：發明
國別省市：