一種將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法技術

一種將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，將第一目標重組質粒電轉化第一重組菌，然后將轉化得到的菌經單、雙同源重組雜交培養，得到第一目標菌，所述第一目標菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩定表達和分泌外源基因編碼蛋白；或將第二目標重組質粒電轉化第二重組菌，然后將轉化得到的菌經單、雙同源重組雜交培養，得到第二目標菌，所述第二目標菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內無actA基因和plcB基因，且在其基因組內orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩定表達和分泌外源基因編碼蛋白。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種將外源基因整合至綿羊李斯特菌(Listeria ivanovii,在下文中簡稱Li)基因組的方法。
技術介紹
Li屬于李斯特菌屬，僅對綿羊等動物致病，不對人致病，具有與李斯特菌屬內另一種菌-單增李斯特菌(Listeria monocytogenes,在下文中簡稱Lm)相似的生物學特性。Lm由于具有獨特的能在感染的宿主吞噬細胞漿內生長的生物學特性，成為了良好的T細胞免疫活化佐劑，已在疫苗制備上得到了廣泛應用，部分以Lm為載體的重組活菌治療性腫瘤疫苗已進入臨床試驗階段。如Wood LM et al.報道構建的兩種基因重組Lm活菌疫苗(Lm-LLO-⑶105A和Lm-LLO-⑶105B)能顯著減小乳腺癌小鼠動物模型的原發性和轉移性腫瘤組織體積、降低乳腺癌自發小鼠模型腫瘤發生率(Wood LM, Pan ZK, Guirnalda P，et al.Targeting tumor vasculature with novel Listeria-based vaccines directedagainst CD105.Cancer Tmmunol Immunother.2011，60 (7):931_942)。雖然以 Lm 為載體的重組活菌疫苗免疫保護效果較好，但由于Lm可對人致病，故作為載體的Lm需經嚴格地敲除致病相關基因進行減毒，且此類疫苗目前只能限制在特殊人群(如癌癥病人)中小范圍應用。與Lm同屬李斯特菌屬的Li因具有與Lm相似的生物學特性(能在吞噬細胞等宿主細胞漿內增殖)，決定了其也具有活化T細胞免疫應答的佐劑效應，再加上其相對于Lm而言的低毒安全性，因此可望代替Lm在疫苗制備上發揮更廣泛的作用。要制備以Li為載體的重組活菌疫苗，需要將外源基因整合至Li基因組，但目前將外源基因整合至Li基因組 的方法尚未見公開報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術的不足，提供。本專利技術所述將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法包括以下步驟:(I)將從含有擬整合外源基因的生物基因組模板或基因克隆質粒庫內PCR擴增得到的上游帶Hind III酶切位點、下游帶Xho I酶切位點的外源擬整合基因，插入第一重組質粒(命名為PCW203)的Hind III酶切位點與Xho I酶切位點之間，得到中間重組質粒，所述第一重組質粒的基因序列為序列表中SEQ ID N0.1所示；(2)切下步驟(I)得到的中間重組質粒的BamH I酶切位點與Xho I酶切位點之間的片段插入第二重組質粒(命名為PCW153)的BamH I酶切位點與Xho I酶切位點之間，得到第一目標重組質粒，所述第二重組質粒的基因序列為序列表中SEQ ID N0.2所示；或切下步驟(I)得到的中間重組質粒的BamH I酶切位點與Xho I酶切位點之間的片段插入第三重組質粒(命名為PCW154)的BamH I酶切位點與Xho I酶切位點之間，得到第二目標重組質粒，所述第三重組質粒的基因序列為序列表中SEQ ID N0.3所示；(3)將步驟(2)得到的第一目標重組質粒電轉化第一重組菌(命名為LilacZ)，然后將轉化得到的菌經單、雙同源重組雜交培養，得到第一目標菌，所述第一重組菌為一種重組綿羊李斯特菌，在其基因組orfBAldh基因上游整合入了 β -半乳糖苷酶基因，能表達β -半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷的培養基上長成藍色菌落，所述第一目標菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩定表達和分泌外源基因編碼蛋白；或將步驟(2)得到的第二目標重組質粒電轉化第二重組菌(命名為Li AactAlacZ)，然后將轉化得到的菌經單、雙同源重組雜交培養，得到第二目標菌，所述第二重組菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內無actA基因和plcB基因，且在其基因組orfBAldh基因上游整合入了 β-半乳糖苷酶基因，能表達半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷的培養基上長成藍色菌落，所述第二目標菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內無actA基因和plcB基因，且在其基因組內orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩定表達和分泌外源基因編碼蛋白。上述方法中，制備第一重組質粒(pCW203)的步驟如下:(I)擴增豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,在下文中簡稱PRRSV)包膜蛋白GP5編碼基因0RF5的基因片段(GenBank: JX105430.1)，其上游帶Hind III酶切位點，下游帶Xho I酶切位點；(2)將上述0RF5基因片段插入質粒pHS-LV的Hind III酶切位點與Xho I酶切位點之間，即得第一重組質粒。上述方法中，制備第二重組質粒(pCW153)的步驟如下:(I)擴增上游帶Hind III酶切位點、下游帶Not I酶切位點的Li orfXYZ基因(GenBank:AJ249805.1),并將所述Li orfXYZ基因插入質粒pHS_LV的Hind III酶切位點與Not I酶切位點之間；(2)擴增上游帶Sal I酶切位點、下游帶Spe I酶切位點的Ery基因(序列見序列表的SEQ ID N0.2中(6642)..(8092))，并將所述Ery基因插入步驟(I)所得重組質粒的Sal I酶切位點與Spe I酶切位點之間；(3)擴增上游帶Xba I酶切位點、下游帶Not I酶切位點的Li orfBAldh基因(GenBank:AJ249805.1)，并將所述Li orfBAldh基因插入步驟(2)所得重組質粒的Xba I酶切位點與Not I酶切位點之間；(4)從所述第一重組質粒中擴增上下游分別帶Not I酶切位點的PRRSV 0RF5基因片段I (序列見序列表的SEQ ID N0.1中(10)..(1050))，并將所述PRRSV 0RF5基因片段I插入步驟(3)所得重組質粒的Not I酶切位點；(5)從步驟(4)所得重組質粒中擴增上游帶Bgl II酶切位點、下游帶Sal I酶切位點的PRRSV 0RF5基因片段2 (序列見序列表的SEQ ID N0.3中(4692)..(5456))，并將所述PRRSV 0RF5基因片段2插入步驟(4)所得重組質粒BamH I酶切位點與Xho I酶切位點之間，即得第二重組質粒。上述方法中，制備第三重組質粒(pCW154)的步驟如下: (I)擴增上游帶Hind III酶切位點、下游帶Not I酶切位點的Li mpl基因(GenBank:AY510073.1 )，并將所述Li mpl基因插入質粒pHS-LV的Hind III酶切位點與NotI酶切位點之間；(2)擴增上游帶Sal I酶切位點、下游帶Spe I酶切位點的Ery基因(序列見序列表的SEQ ID N0.2中(6642)..(8092))，并將所述Ery基因插入步驟(I)所得重組質粒的Sal I酶切位點與Spe I酶切位點之間；(3)擴增上游帶Xba I酶切位點、下游帶Not I酶切位點的Li orfBAldh基因(GenBank:AJ249805.1)，并將所述Li orfB本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，其特征在于包括以下步驟：（1）將從含有擬整合外源基因的生物基因組模板或基因克隆質粒庫內PCR擴增得到的上游帶Hind?Ⅲ酶切位點、下游帶Xho?I酶切位點的外源擬整合基因，插入第一重組質粒的Hind?III酶切位點與Xho?I酶切位點之間，得到中間重組質粒，所述第一重組質粒的基因序列為序列表中SEQ?ID?NO.1所示；（2）切下步驟（1）得到的中間重組質粒的BamH?I酶切位點與Xho?I酶切位點之間的片段插入第二重組質粒的BamH?I酶切位點與Xho?I酶切位點之間，得到第一目標重組質粒，所述第二重組質粒的基因序列為序列表中SEQ?ID?NO.2所示；或切下步驟（1）得到的中間重組質粒的BamH?I酶切位點與Xho?I酶切位點之間的片段插入第三重組質粒的BamH?I酶切位點與Xho?I酶切位點之間，得到第二目標重組質粒，所述第三重組質粒的基因序列為序列表中SEQ?ID?NO.3所示；（3）將步驟（2）得到的第一目標重組質粒電轉化第一重組菌，然后將轉化得到的菌經單、雙同源重組雜交培養，得到第一目標菌，所述第一重組菌為一種重組綿羊李斯特菌，在其基因組orfBAldh基因上游整合入了β?半乳糖苷酶基因，能表達β?半乳糖苷酶，在含5?溴?4氯?3?吲哚?β?D?半乳糖苷的培養基上長成藍色菌落，所述第一目標菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩定表達和分泌外源基因編碼蛋白；或將步驟（2）得到的第二目標重組質粒電轉化第二重組菌，然后將轉化得到的菌經單、雙同源重組雜交培養，得到第二目標菌，所述第二重組菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內無actA基因和plcB基因，且在其基因組orfBAldh基因上游整合入了β?半乳糖苷酶基因，能表達β?半乳糖苷酶，在含5?溴?4氯?3?吲哚?β?D?半乳糖苷的培養基上長成藍色菌落，所述第二目標菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內無actA基因和plcB基因，且在其基因組內orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩定表達和分泌外源基因編碼蛋白。...

【技術特征摘要】
1.一種將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，其特征在于包括以下步驟: (I)將從含有擬整合外源基因的生物基因組模板或基因克隆質粒庫內PCR擴增得到的上游帶Hind III酶切位點、下游帶Xho I酶切位點的外源擬整合基因，插入第一重組質粒的Hind III酶切位點與Xho I酶切位點之間，得到中間重組質粒，所述第一重組質粒的基因序列為序列表中SEQ ID N0.1所示； (2 )切下步驟(I)得到的中間重組質粒的BamH I酶切位點與Xho I酶切位點之間的片段插入第二重組質粒的BamH I酶切位點與Xho I酶切位點之間，得到第一目標重組質粒，所述第二重組質粒的基因序列為序列表中SEQ ID N0.2所示； 或切下步驟(I)得到的中間重組質粒的BamH I酶切位點與Xho I酶切位點之間的片段插入第三重組質粒的BamH I酶切位點與Xho I酶切位點之間，得到第二目標重組質粒，所述第三重組質粒的基因序列為序列表中SEQ ID N0.3所示； (3)將步驟(2)得到的第一 目標重組質粒電轉化第一重組菌，然后將轉化得到的菌經單、雙同源重組雜交培養，得到第一目標菌，所述第一重組菌為一種重組綿羊李斯特菌，在其基因組orfBAldh基因上游整合入了 β-半乳糖苷酶基因，能表達半乳糖苷酶，在含5-溴_4氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷的培養基上長成藍色菌落，所述第一目標菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩定表達和分泌外源基因編碼蛋白； 或將步驟(2)得到的第二目標重組質粒電轉化第二重組菌，然后將轉化得到的菌經單、雙同源重組雜交培養，得到第二目標菌，所述第二重組菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內無actA基因和plcB基因，且在其基因組orfBAldh基因上游整合入了 β -半乳糖苷酶基因，能表達β -半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷的培養基上長成藍色菌落，所述第二目標菌為一種重組綿羊李斯特菌，其基因組內無actA基因和plcB基因，且在其基因組內orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能穩定表達和分泌外源基因編碼蛋白。2.根據權利要求1所述將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，其特征在于制備第一重組質粒的步驟如下: (1)擴增豬繁殖與呼吸綜合征病毒包膜蛋白GP5編碼基因0RF5的基因片段，其上游帶Hind III酶切位點，下游帶Xho I酶切位點； (2)將步驟(I)所述0RF5基因片段插入質粒pHS-LV的HindIII酶切位點與Xho I酶切位點之間，即得第一重組質粒。3.根據權利要求1所述將外源基因整合至綿羊李斯特菌基因組的方法，其特征在于制備第二重組質粒的步驟如下: (1)擴增上游帶HindIII酶切位點、下游帶Not I酶切位點的綿羊李斯特菌orfXYZ基因，并將所述orfXYZ基因插入質粒pHS-LV的Hind III酶切位點與Not I酶切位點之間； (2)擴增上游帶SalI酶切位點、下游帶SpeI酶切位點的Ery基因，并將所述Ery基因插入步驟(I)所得重組質粒的Sal I酶切位點與Spe I酶切位點之間； (3)擴增上游帶XbaI酶切位點、下游帶Not I酶切位點的綿羊李斯特菌orfBAldh基因，并將所述orfBAldh基因插入步驟(2)所得重組質粒的Xba I酶切...

【專利技術屬性】
技術研發人員：汪川，沈海淺，
申請(專利權)人：上海頌悅實業有限公司，汪川，
類型：發明
國別省市：