一種動物飼料抗菌肽的生產工藝及其應用制造技術

本發明專利技術涉及一種動物飼料抗菌肽的生產工藝及其應用，尤其是抗菌肽家族中Gallinacin系列中的GAL-6的生產工藝及其應用。該工藝利用基因重組技術，將動物源性的GAL-6基因克隆到質粒pGEM-3Zf，并以pGEM-3Zf-GAL-6為模板，用PCR方法獲得GAL-6基因，構建表達質粒pPIC9K-GAL-6，并轉化畢赤酵母；經多級放大培養至中試生產后，全面優化發酵培養條件，放大到生產化發酵培養，經純化后得到高純度、活性好的成品GAL-6蛋白制劑。該蛋白制劑的應用采用動物飲水或顆粒飼料制粒后噴涂的方法以克服高溫、高壓等對蛋白制品的破壞性。與現有技術相比，本發明專利技術具有工藝簡單、適合大規模工業化生產等特點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及動物飼料添加劑，尤其涉及一種動物飼料抗菌肽的生產工藝及其應用。
技術介紹
2005年7月，四川省資陽、內江等地爆發豬鏈球菌病疫情致人死亡，這再次迫使人們追問:動物濫用抗生素的威脅鏈到底有多長？由于抗生素飼料添加劑可以提高動物生產效率，在食用動物飼養中被廣泛使用。1996年，全世界抗生素飼料添加劑的用量已經占全部飼料添加劑用量的45.8%，抗生素生產總產量的50%左右用于畜牧業。但是，由于持續低水平飼喂抗生素，抗生素飼料添加劑造成的細菌耐藥性、畜產品藥物殘留、過敏中毒反應以及“三致”作用等危害日益嚴重，越來越受到人們的關注和許多國家的限制。1986年，瑞典成為第一個不準使用抗生素作為飼料添加劑的國家，全面禁止在畜禽飼料中使用抗生素。1997年 ，聯合國糧農組織(FAO)要求停止或禁止使用抗生素飼料添加劑。1998年12月又提議在10年內淘汰抗生素飼料添加劑。從2000年I月起，丹麥的抗生素只限于按處方用于治療動物疾病。歐盟委員會決定從2006年I月I日起，在歐盟成員國全面停止使用所有抗生素生長促進劑，包括離子載體類抗生素。2004年，世界衛生組織(WHO)、FA0和世界動物衛生組織(OIE)聯合召開了一次專題討論會，討論了非人用抗生素的使用和抗生素的耐藥性問題。討論會的報告建議，在食用動物生產中停止使用也用于治療人類疾病的抗生素飼料添加劑，直到進行風險評估后認為對人類健康沒有影響后才可以使用。報告還建議，進行國家水平的風險評估研究，建立監測制度，對抗生素飼料添加劑使用和食用動物細菌的耐藥性情況進行監測。同時，世界各國對進口動物性食品抗生素殘留要求也越來越嚴格。2002年8月瑞士對我國輸入的禽肉產品繼諾沙星、氯霉素后又開始檢測硝基呋喃，且檢測限量標準由原來的5ppb提高到lppb。到2003年，歐盟共發布了 37個有關食品中農獸藥最高殘留限量(MRL)的指令，制定出了 194種農獸藥在肉、蛋、乳等190種食品中共28689項MRL標準，其中有3/4以上的MRL標準設定在檢測線上。俄羅斯對進口凍肉類檢測獸藥殘留的數量原來僅為10種，現在增加到59種，其中有35種不得檢出。最近，日本通過了《食品衛生法》及其修正案，推行“可用農藥清單制度”和“一律基準制度”，對農產品使用的農獸藥列出詳細清單，農產品被檢出農獸藥殘留超標或檢出清單中未設定限量的農獸藥殘留將不允許進口，并將現有的130種農產品、229種農獸藥、9000個殘留標準增加到135種農產品、724種農獸藥、19000個殘留標準。同時日本厚生勞動省宣布對我國出口雞肉產品實施批批檢驗。2002年初，歐盟從中國進口的蝦、對蝦中發現強力抗生素的藥物殘留，認為對人體健康構成潛在威脅，導致歐洲部分地區陷入食品恐慌。受到進口限制影響的中國動物產品包括:兔肉、禽肉、蜂蜜、軟體動物肉類、甲殼類、凍蝦、對蝦和寵物產品等。2006年3月22日至31日，歐盟殘留監控團對我國海南等10個省市的動物源性食品殘留監控工作進行考察，其考察結果直接影響我國禽畜產品在海外的聲譽及市場份額。從現狀和發展趨勢看，在食用動物中禁用、限用抗生素飼料添加劑已經成為世界共識，是大勢所趨。從利弊分析和發達國家的做法看，抗生素飼料添加劑的發展呈現三個趨勢，一是使用將日益受到限制，二是積極選擇替代品，三是對進口動物性食品抗生素殘留檢驗越來越嚴格。但禁用抗生素飼料添加劑會導致飼養成本的增加，主要原因:一是由于動物發病率提高加大治療費用，二是由于飼養管理更加嚴格會增加管理費用。據美國學者2002年的統計結果，使用抗生素作為飼料添加劑，動物可以平均增重4% 5%;如果停止使用抗生素飼料添加劑，肉雞的生產過程每年將多花30億美元。因此，為確保養殖業的健康發展，在動物飼養過程中推行更為安全、有效的替代添加劑刻不容緩。多年來在畜禽或水產養殖中，之所以對抗生素產生依賴，是人們希望用抗生素來發揮防病保健和提高動物的生產效率。但是在過去的50多年中，人類的防病觀念和防病策略存在著嚴重的片面性或錯誤，即一味地強調“抑制或殺滅有害微生物”，卻忽視了由動物的正常菌群、免疫與營養構成的“微生態三角”的防病保健、營養等重要作用。因此調節腸道中細菌活性的措施是有效的，可用來策略性地改善動物生產性能和維持現代家畜生產體系中的生產效率。目前，飼料抗生素的替代方式主要有兩種，其一為飼喂微生物添加劑即益生素(菌)來改善腸道微生物的比例，抑制有害微生物，促進動物生長；其二為使用飼用酸化劑，改善腸道內容物的酸堿度，抑制有害菌，促進有益菌生長。但總體而言，以上兩種措施相對于抗生素的作用仍然有一定的差距。 各種動物在長期的自然進化過程中在體內已建立了平衡的微生物菌群共生生態系統，并建立了一套維持其體內菌群穩態的機制，抗菌肽是這一機制中的主要因子之一在維持腸道正常菌群平衡中起著非常重要的作用，并可能與腸道粘膜免疫有一定的關系。與抗生素相比，抗菌肽的抑菌活性更高、抑菌范圍更廣，對于動物的生產性能也具有明顯的促進作用；更為重要的是，抗菌肽不會產生任何的耐藥性；因此，研制和開發出合適的抗菌肽，將是飼料抗生素的最佳替代品。抗菌肽又稱防御素(defensin)，是人體內主要的防御素，包括α抗菌肽和β抗菌肽兩種。其中β抗菌肽主要來源于皮膚、呼吸道等上皮組織，目前已發現4種人體β抗菌肽。抗菌肽也是廣泛存在于動、植物體內的內源性抗微生物多肽。富含精氨酸，具有穩定的分子結構和眾多的生物活性，是生物體天然免疫的重要組成成分。根據抗菌肽氨基酸數量、半胱氨酸位置以及分子內二硫鍵連接方式不同可分為植物抗菌肽、昆蟲抗菌肽、α-抗菌肽、β -抗菌肽和Θ -抗菌肽自從1972年瑞典科學家Boman等首先在果蠅中發現抗菌肽及其免疫功能以來,迄今為止，已在各種生物體內發現300多種內源性抗菌肽。這些多肽可大致分為四類:殺菌肽類、富含pro殘基的娃皮素、富含gly殘基的蜂毒素和富含cys殘基的抗菌肽。Harwing S1994年首次發現雞抗菌肽的存在抗菌肽具有廣譜的抗細菌活性、高效的抗真菌、病毒和原蟲的活性，并且不易產生抗藥性；高等動物抗菌肽更是具有“種”的特異性，不同動物的腸道內源性抗菌肽能抑制其相應的外源性病原菌，而對動物腸道中共生生態系統中的微生物和動物細胞無殺傷作用。應用各種專一性抗菌肽作為的飼料添加劑，可使動物在收到各種外源性的病原菌入侵或應激時能夠保持特異性的生長。(溫劉發等，2001)。許多研究者已試圖將抗菌肽應用于畜牧業生產中，用以取代抗生素。溫劉發等(2001)通過在斷奶仔豬的飼料中用抗菌肽代替抗生素，對仔豬的腹瀉、生產性能等作了比較。結果表明，抗菌肽在仔豬斷奶應激期間抗腹瀉效果不比抗生素差，適量的抗菌肽比抗生素促生長的效果要好，但高劑量的抗菌肽則降低了仔豬的生長。黃永彤等(2004)發現，抗菌肽對肉雞有促進生長和提高免疫力作用，與中草藥抗生素相比，在出欄率、平均體重、飼料效率等方面均無顯著性差異，且在出欄前3d停喂，抽檢無殘留。溫劉發等(2001)通過飲水方式給粵黃雞添加抗菌肽的飼養試驗結果表明，抗菌肽可促進小雞生長和減少排泄物氮含量。陳曉生等(2005)于肉鴨日糧中添加液體的蠶抗菌肽AD-酵母制劑發現，血清代謝激素的活動顯著增強，IGF-1濃本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種動物飼料抗菌肽的生產工藝，其特征在于：利用基因重組技術，將動物源性的GAL?6基因克隆到質粒pGEM?3Zf，并以pGEM?3Zf?GAL?6為模板，用PCR方法獲得GAL?6基因，構建表達質粒pPIC9K?GAL?6并轉化畢赤酵母；經多級放大培養至中試生產后，全面優化發酵培養條件，放大到生產化發酵培養，經提取純化得到高純度、高活性成品GAL?6蛋白制劑。

【技術特征摘要】
1.一種動物飼料抗菌肽的生產工藝，其特征在于:利用基因重組技術，將動物源性的GAL-6基因克隆到質粒pGEM-3Zf，并以pGEM_3Zf-GAL_6為模板，用PCR方法獲得GAL-6基因，構建表達質粒PPIC9K-GAL-6并轉化畢赤酵母；經多級放大培養至中試生產后，全面優化發酵培養條件，放大到生產化發酵培養，經提取純化得到高純度、高活性成品GAL-6蛋白制劑。2.根據權利要求1所述的一種動物飼料抗菌肽的生產工藝，其特征在于，包括以下步驟:1).畢赤酵母PPIC9K-GAL-6表達質粒的構建:將動物源性的GAL-6基因克隆到質粒pGEM-3Zf，并以pGEM-3Zf-GAL-6為模板，用上、下游引物擴增GAL-6基因；反應條件是:94°C變性3分鐘；然后94°C變性40s，40°C退火40s，72°C延伸60s，進行5 30個循環；然后94°C變性40s，55°C退火40s，72°C延伸60s，進行20 40個循環；最后72°C延伸5分鐘，4°C保溫；PCR產物通過EcoRI和NotI酶切位點與質粒PPIC9K連接重組，轉化感受態大腸桿菌；挑陽性克隆抽提質粒后進行EcoRI和NotI雙酶切鑒定，經PCR擴增得到基因DNA片段長502bp，電泳分析結果顯示在400bp 600bp處有特異性條帶，與預測片段長度一致，重組質粒酶切鑒定片段長度與理論預測一致，核苷酸序列分析結果完全正確，并測定DNA序列；重組質粒命名為PPIC9K-GAL-6 ；2).電轉化畢赤酵母及篩選多拷貝陽性克隆:參照 Invitrogen 公司 Mult1-Copy Pichia Expression Kit 說明書操作；用 Sal I 酶切重組質粒PPIC9K-GAL-6·，使其完全線性化，經酚/氯仿抽提、乙醇沉淀純化后電轉化感受態畢赤酵母GS ;電擊參數為:電壓1500V，電容25yF，電阻200Ω ;涂布MD平板，30°C靜置培養48h ;挑單克隆菌落接種至96孔細胞培養板，經同步化后分別接種至含O、1.0,2.0,4.0g/LG418的YPD平板上，30°C靜置培養至長出單克隆菌落；3).PCR法鑒定:在高濃度G418-YPD平板上挑單克隆至20 μ L0.25 % SDS溶液中，混勻后90 V加熱3min，離心后取I μ L上清作模板，用上游引物和下游引物進行PCR反應；反應體系50 μ L，含 1% Triton X-100 ;反應條件:95°C 變性 5min ;95 °C變性 60s，55 °C退火 60s，72 °C 延伸60s，進行20 50個循環；最后72°C延伸3min，4°C保溫；根據PCR結果酶切后電泳鑒定重組質粒；4).實驗室培養:在高濃度G418-YPD平板上挑單克隆于YPD培養液中，30°C，250r/min振蕩培養12h，得到一級種子液；將一級種子液接種至1200mL BMGY培養液中，振蕩培養16h，至0D600 =10 12，得到二級種子液；將二級種子液接種至20LBMMY培養液中，用28%氨水調節pH至5.0 ;發酵培養條件為:溫度30°C，攪拌速度200r/min，溶氧度35%，自動補加氨水維持PH5.1 ;繼續培養18h至0D600 = 100 120，待溶氧度快速上升，培養液中甘油耗盡時開始補加50%甘油溶液，速度80mL/h，時間2 3h，至0D600 = 150 160時停止補加甘油，待其完全耗盡時立即開始補加甲醇進行誘導表達，速度30mL/h，時間30h ;誘導表達結束后，發酵液放入冷卻罐，按放罐發酵液質量3%的量加入固體NaCl，攪拌至鹽溶解，待溫...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鐘誠，
申請(專利權)人：上海高龍生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：