本發明專利技術公開了一種肌肉組織特異性表達Follistatin以提高牛瘦肉率的轉基因載體，所述轉基因載體含有小鼠的肌酸激酶(muscle?creatine?kinase，MCK)增強子、2.7kb牛的α-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子、牛的Follistatin的cDNA和牛生長激素基因的3’端不翻譯區域，且帶有哺乳動物細胞中篩選用的抗性基因-嘌呤霉素基因和原核細胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素基因。本發明專利技術的轉基因載體可應用于體細胞克隆，以構建高瘦肉率的Follistatinmus轉基因牛。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程
，具體涉及一種肌肉組織特異性表達Follistatin以提高牛瘦肉率的轉基因載體。
技術介紹
牛肉作為中國人民的主要肉類食品之一，保證全國人民有充足的、優質的牛肉供應是關系到人民日常生活的重要事件。而隨著人口的增長和人民生活水平的提高，除了對牛肉的需求量增加以外，對牛肉的質量和口感的要求也提高了。因此,有必要建立和改良中國自己的牛的品種，改善牛肉口感和質量，以滿足人民群眾的生活需求。Follistatin是由肌肉細胞分泌到血液中的一種糖蛋白，它可與抑制肌肉生長的Myostatin結合,從而拮抗Myostatin的功能,進而促進肌肉的生長。已在小鼠和猴中通過實驗證明，將表達Follistatin的腺病毒群(Adeno-associated Virus)注射到肌肉中，可有效地促進肌肉的生長，不僅提高了肌肉的重量，還增強了肌肉的力量(Haidet A.M.etal. Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single geneadministration of myostatin inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA,2008.105:4318-4322 ；Kota, J.et al.“Follistatin gene delivery enhances muscle growth andstrength in nonhuman primates”.Sci Transl Med, 2009.1,6ral5)。基于這些數據，我們預期在牛的骨骼肌中過表達Follistatin可提高牛的瘦肉率,并可改善肌肉的品質。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是一種能在肌肉組織特異性表達Follistatin以提高牛瘦肉率的轉基因載體。為解決上述技術問題，本專利技術采用的技術方案如下:一種能在肌肉組織特異性表達Follistatin以提高牛瘦肉率的轉基因載體包含小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase,MCK)增強子、2.7kb牛的α-骨骼肌肌動蛋白(a -skeletal actin)基因的啟動子、牛的Follistatin的cDNA和牛生長激素基因(bGH)的3’端不翻譯區域，且帶有哺乳動物細胞中篩選用的抗性基因-嘌呤霉素(PuiOmycin)基因和原核細胞中篩選用的抗性基因-博萊霉素(Zeocin)基因(見圖2)。2.7kb的α-骨骼肌肌動蛋白(a-skeletal actin)的啟動子可保證下游的基因在骨骼肌中特異表達，而且MCK增強子也具有肌肉組織特異性的增強子活性，可特異地促進下游基因的高表達。在此轉基因載體中表達的是牛自身的Follistatin基因，所以從食品安全的角度講，對消費者的健康沒有任何影響。此外，本專利技術在嘌呤霉素和博萊霉素抗性基因的兩端還加入LoxP序列，這樣，在Follistatin基因整合到基因組DNA后，如有需要，本專利技術可通過表達Cre蛋 白，誘導LoxP序列的重組，以除去抗性基因，進一步保障轉基因動物的食品安全性。本專利技術構建的肌肉組織特異表達牛Follistatin的轉基因載體pHJ20的全序列如SEQ ID No:1所示，其中第5-1039堿基為牛Follistatin編碼區，第1059-1272堿基為bGH 3’端不翻譯區，第1448-1481堿基為LoxP，第1837-2508堿基為嘌呤霉素抗性基因，第2566-2937堿基博萊霉素(Zeocin)抗性基因，第2952_2985LoxP堿基為4458-4804 MCK增強子，第5110-7857堿基為牛α -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子。本專利技術的轉基因載體可應用于體細胞克隆，以構建高瘦肉率的Follistatin.轉基因牛。附圖說明圖1是本專利技術的技術流程圖。圖2是本專利技術構建的PHJ20轉基因載體的示意圖。具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本專利技術。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本專利技術，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本專利技術。實施例1:插入 LoxP-Puro-Zeo-LoxP 片段,構建 pZTl。將pO)NA3.I (myc-His) a 載體(Invitrogen)用 PvuII 酶切，酶切體系為 2 μ g 質粒DNA, 3 μ I 10 Xbuffer, 2 μ I PvuII 酶，加入 ddH20 補足體積至 30 μ 1，37°C溫浴 3 小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出3.3kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步 驟為，將紫外光下切下目的DNA條帶裝入1.5ml離心管中，稱重后加入3倍體積的溶膠液，55°C保溫10分鐘，使瓊脂糖凝膠完全融化；融化的凝膠待溫度降至室溫后，將混合液轉入附柱中，10，OOOg離心I分鐘，倒掉流出液；加入650 μ I漂洗緩沖液，10，OOOg離心I分鐘，倒掉流出液；吸附柱再次離心，10，OOOg離心，I分鐘，倒掉流出液；將吸附柱轉移到一個新的1.5ml離心管中，加入50 μ I ddH20，放置I分鐘，10，OOOg離心I分鐘收集純化產物。從pSNAP載體用EcoRV酶切出LoxP-Puro-Zeo-LoxP片段,酶切體系為3 μ g質粒DNA, 3 μ I 10 Xbuffer, 2 μ I EcoRV 酶，加入 ddH20 補足體積至 30 μ 1，37°C溫浴 3 小時。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出1.7kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。具體步驟同上。將pCDNA3.1 (myc-His) a(PvuII)和 LoxP-Puro-Zeo-LoxP (EcoRV)連接，連接反應中加入2μ I載體，6μ I插入片段，1μ I 10Xbuffer，I μ I T4DNA連接酶，16°C溫浴16小時。將連接產物轉化到E.coli的感受態細胞中。取一管50 μ I的Trans5 α感受態細胞置于冰上，待其融化后，向其中加入4μ I上述連接產物，輕彈混勻，后于冰上孵育30分鐘；42°C熱擊30秒，后冰上靜置10分鐘；加入500 μ I無抗性的LB液體培養基，37°C震蕩培養I小時；4，OOOrpm離心5分鐘，吸走，保留100 μ I左右的培養基，用移液器將細菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨節和博萊雙抗性的LB培養基平板上。然后將平板置于37°C溫箱培養16小時。克隆生長出來后，挑單克隆菌落至3ml含氨芐青霉素的LB培養液中，37°C震蕩培養12小時，提取質粒DNA，用EcoRI酶切鑒定，陽性克隆中可得到2.9kb和2.0kb的兩條DNA條帶。再通過測序進一步確定陽性克隆的正確性，得到的克隆即為PZT1。實施例2:插入牛α-骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子DNA片段，構建pZT2。將pZTl用PvuI和NdeI雙酶切，酶切體系為2yg質粒DNA，3y I 10Xbuffer,1.5μ I PvuI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20補足體積至30μ 1，37°C溫浴3小時。然后將酶切體系在I %的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
肌肉組織特異性表達Follistatin以提高牛瘦肉率的轉基因載體，其特征在于，所述轉基因載體含有小鼠的肌酸激酶增強子、2.7kb牛的α?骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子、牛的Follistatin的cDNA和牛生長激素基因的3’端不翻譯區域，且帶有哺乳動物細胞中篩選用的抗性基因?嘌呤霉素基因和原核細胞中篩選用的抗性基因?博萊霉素基因。
【技術特征摘要】
1.肌肉組織特異性表達FolliStatin以提高牛瘦肉率的轉基因載體，其特征在于，所述轉基因載體含有小鼠的肌酸激酶增強子、2.7kb牛的α -骨骼肌肌動蛋白基因的啟動子...
【專利技術屬性】
技術研發人員：戴一凡，陳凌懿，
申請(專利權)人：南京醫科大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。