本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種以含PEG的異型雙功能試劑作橋連劑的新型多糖結(jié)合疫苗制備技術(shù)，并基于此技術(shù)，開發(fā)出了腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗，此技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于：（1）避免了傳統(tǒng)工藝中多糖和蛋白質(zhì)各自的自身交聯(lián)，提高了產(chǎn)率，也利于質(zhì)量控制；（2）長(zhǎng)的PEG鏈可增大多糖和蛋白質(zhì)之間的距離，降低兩者之間相互的空間屏蔽效應(yīng)，提高多糖結(jié)合疫苗的免疫原性。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)提供了一種新型的制備腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的結(jié)合技術(shù)；基于此結(jié)合技術(shù)，制備 出了腦膜炎莢膜多糖結(jié)合疫苗，可用于腦脊髓膜炎等重要疾病的免疫預(yù)防，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
流行性腦膜炎是由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的腦膜發(fā)炎的疫癥，至今仍未得到有效控制。腦膜炎奈瑟氏球菌主要經(jīng)由咳嗽，噴嚏或接吻傳播，由鼻咽部侵入血循環(huán)，最后局限于腦膜和脊髓膜，形成化膿性腦脊髓膜病變。常見的病征包括發(fā)高燒、劇烈頭痛、后頸僵硬；亦會(huì)有嗜睡、嘔吐、懼光或皮疹等情況出現(xiàn)。此病可引致腦部受損甚至死亡，病死率較高，維持在5-10%之間，遍見于世界各國(guó)，呈散發(fā)或大、小流行，以兒童發(fā)病率為高。使用抗生素可以有效治療流行性腦膜炎。在未使用抗生素以前該病的病死率在70%左右，使用抗生素治療以來(lái)病死率降低至5% 15%，甚至低于5%。然而，由于抗生素的過度使用，細(xì)菌的耐藥菌株數(shù)量和種類迅速地增長(zhǎng)，導(dǎo)致治療更加困難。這引起了醫(yī)學(xué)界的廣泛憂慮，并增加了病人的治療成本和難度。為了應(yīng)對(duì)不斷惡劣化的抗藥性病菌對(duì)人類的威脅，世界各地的醫(yī)生開始嚴(yán)格地控制使用抗生素，同時(shí)擴(kuò)大疫苗的接種范圍。因此，研制與開發(fā)預(yù)防流行性腦膜炎的疫苗具有十分重大的意義。腦膜炎奈瑟氏菌根據(jù)其莢膜多糖的特異性可將腦膜炎球菌分成A、B、C、D、29E、H、1、K、L、W135、X、Y、Z十三個(gè)血清群，所有血清群的細(xì)菌均可致病，但A、C、W135和Y毒力最強(qiáng)，上述4個(gè)血清群占病例數(shù)的95%以上，是引起腦膜炎流行最常見的菌株。莢膜多糖能夠屏蔽細(xì)菌細(xì)胞表面功能成分，使其免于被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，防止補(bǔ)體系統(tǒng)被細(xì)菌表面的蛋白激活和免疫細(xì)胞吞噬。如果細(xì)菌被免疫細(xì)胞吞噬，莢膜多糖也能夠避免細(xì)菌被殺滅。莢膜多糖是腦膜奈瑟氏菌的主要抗原成分之一，作為疫苗對(duì)較大的兒童有一定的保護(hù)力。然而，莢膜多糖對(duì)2歲以下嬰幼兒、老年人以及B細(xì)胞免疫缺陷的人群免疫效果差，接種劑不能達(dá)到抗體保護(hù)水平，且抗體很快消失。該多糖疫苗與其它多糖疫苗一樣，屬T細(xì)胞非依賴性抗原，具有年齡相關(guān)的免疫原性，且不誘生T細(xì)胞依賴性的加強(qiáng)應(yīng)答。通過將多糖與某種蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，可使多糖轉(zhuǎn)化成T細(xì)胞依賴性抗原，從而刺激嬰幼兒的T細(xì)胞依賴性抗體的合成，并可產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答，同時(shí)還能提高免疫球蛋白(IgG)的抗體比例。這種多糖結(jié)合疫苗不僅能夠保護(hù)嬰幼兒(2歲以下兒童)，還能夠大大地增強(qiáng)抵抗力差的病人對(duì)細(xì)菌感染的抵抗力，因此具有十分廣闊的應(yīng)用前景。細(xì)菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合疫苗最早出現(xiàn)在20世紀(jì)30年代，Goebel和Avery將3型肺炎球菌多糖連接到馬血清球蛋白上，產(chǎn)生的偶聯(lián)物能在動(dòng)物身上產(chǎn)生多糖專一的抗體，同時(shí)提供相應(yīng)的免疫保護(hù)。1987年，世界上第一個(gè)多糖蛋白結(jié)合疫苗，B型流感嗜血桿菌(HiB)多糖-破傷風(fēng)類毒素(TT)結(jié)合疫苗被美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)。默克公司、輝瑞公司和諾華公司相繼開發(fā)了 HiB多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗和流行性腦膜炎多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗，并成功上市。中國(guó)專利(ZL02159032.X)公開了一種多糖-蛋白結(jié)合疫苗的制備方法，也是目前制備多糖結(jié)合疫苗最常使用的技術(shù)之一。在該技術(shù)中，以己二酸二酰肼(ADH)作為連接劑結(jié)合多糖與蛋白。這種結(jié)合方式首先需要將多糖經(jīng)溴化氰活化，即在堿性條件下用溴化氰作用于多糖分子上的羥基，形成氰酸酯，然后與ADH反應(yīng)；氰酸酯中的一個(gè)碳氧鍵斷裂，與ADH—端的氨基發(fā)生加成反應(yīng)，從而將酯酰肼(AH)基團(tuán)導(dǎo)入多糖分子，形成多糖-AH衍生物；多糖-AH衍生物在碳二亞胺(EDAC)的介導(dǎo)下與載體蛋白形成穩(wěn)定的結(jié)合物。這樣的結(jié)合方式可減少多糖與載體蛋白結(jié)合的空間位阻，保留了多糖的抗原表位，同時(shí)避免了多糖本身的溶解性，減少多糖與抗血清反應(yīng)的副作用。然而，上述傳統(tǒng)的多糖-蛋白結(jié)合技術(shù)存在著以下不足之處:(I)多糖-AH衍生物會(huì)繼續(xù)與溴化氰活化的多糖反應(yīng)，形成多糖的自身聚合物，降低了多糖-蛋白的結(jié)合效率；(2)EDAC在介導(dǎo)ADH衍化多糖與載體蛋白結(jié)合的同時(shí)，容易弓丨起多糖與載體蛋白的自身交聯(lián)，從而降低多糖-蛋白的結(jié)合效率；(3)多糖和載體蛋白均為大型生物分子，中間靠?jī)H有6個(gè)碳原子長(zhǎng)度的ADH相連，多糖和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)勢(shì)必會(huì)相互影響，使得多糖的一些重要抗原表位易被蛋白質(zhì)所屏蔽，進(jìn)而降低多糖的免疫原性。因此，多糖-蛋白結(jié)合疫苗的免疫原性和抗體持效性仍有待進(jìn)一步提高，如多糖結(jié)合疫苗需要免疫三次才能產(chǎn)生免疫效果。這些不足之處限制了多糖結(jié)合疫苗的進(jìn)一步發(fā)展。聚乙二醇(PEG)是一種安全的、良好水溶性、無(wú)免疫原性、無(wú)毒的聚合物，并被美國(guó)FDA批準(zhǔn)在人體使用。PEG作為一種修飾劑已在開發(fā)蛋白質(zhì)藥物和運(yùn)載藥物的脂質(zhì)體方面獲得廣泛應(yīng)用，并取得良好的效果。2006年，Singh等(Vaccine, 2006，24:4161-4166)發(fā)現(xiàn)在包埋HIV-1的gp41表位的脂質(zhì)體分子上引入PEG可增強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)效果。據(jù)推測(cè)是由于PEG分子能在脂質(zhì)體周圍形成水化層，導(dǎo)致免疫細(xì)胞吞噬作用下降，從而增強(qiáng)了疫苗的免疫持效性；同時(shí)，PEG分子還增加了抗體中和抗原的難度，從而增強(qiáng)了抗體產(chǎn)生強(qiáng)度。因此，將PEG分子作為連接橋來(lái)制備多糖-蛋白結(jié)合疫苗，預(yù)計(jì)能提高結(jié)合疫苗的免疫原性和抗體持效性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供了一種以異型雙功能試劑為連接橋來(lái)制備多糖結(jié)合疫苗的技術(shù)，制備出了腦膜炎莢膜多糖結(jié)合疫苗。本專利技術(shù)的另一個(gè)目的還在于通過使用PEG作為多糖和蛋白之間的連接橋，進(jìn)一步提高多糖結(jié)合疫苗的免疫原性和抗原持效性。本專利技術(shù)的腦膜炎莢膜多糖結(jié)合疫苗，其中的莢膜多糖為A群、B群、C群、W135群或Y群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖。本專利技術(shù)的腦膜炎莢膜多糖結(jié)合疫苗，其中的蛋白載體為破傷風(fēng)類毒素、CRM197、白喉類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、外毒素A、外膜復(fù)合物C、孔蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌粘附素蛋白質(zhì)、卵清蛋白、牛血清白蛋白或結(jié)核菌素純化蛋白衍生物等。其中，所述的莢膜多糖和載體蛋白的質(zhì)量比為(0.2 3): 1，以1:1為優(yōu)。本專利技術(shù)涉及多糖結(jié)合疫苗的制備工藝 ，包括以下步驟:I)多糖的活化取IOmg多糖溶于生理鹽水中，使其終濃度為5mg/ml。然后，加入溴化氰活化0.5-1.5小時(shí)，溴化氰終濃度為5 μ g/ml。溴化氰活化期間，用0.5M氫氧化鈉維持溶液pH值為10.5?；罨Y(jié)束后，用0.5M的鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至8.5，終止反應(yīng)。然后，分別加入三種不同的異型雙功能試劑(N-2-胺乙基-馬來(lái)酰亞胺，胺-PEG2K-馬來(lái)酰亞胺和胺-PEG5K-馬來(lái)酰亞胺)，多糖與異型雙功能試劑的質(zhì)量比為1: (0.5-10)，于室溫下反應(yīng)6-24小時(shí)；其中優(yōu)化的質(zhì)量比為1:1，于室溫下反應(yīng)16小時(shí)。多糖活化后的氰基與異型雙功能試劑一端的氨基反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用透析袋充分透析，除去未反應(yīng)的溴化氰和異型雙功能試劑。2)載體蛋白的活化載體蛋白溶于生理鹽水中，濃度為8.5mg/ml，然后加入2_亞氨基硫烷(2-1minothiolane)進(jìn)行活化6_24小時(shí)，載體蛋白與2-亞氨基硫燒的摩爾比為1: (10-50)，其中優(yōu)化的活化時(shí)間為16小時(shí)，摩爾比為1:30。2-亞氨基硫烷會(huì)將載體蛋白上暴露在外本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗，以共價(jià)鍵的方式將腦膜炎莢膜多糖連接到載體蛋白上。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗，以共價(jià)鍵的方式將腦膜炎莢膜多糖連接到載體蛋白上。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗，以聚乙二醇(PEG)為連接橋連接腦膜炎莢膜多糖和載體蛋白，PEG的分子量為200-10000Da，優(yōu)化的PEG分子量為2000Da。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗，其特征在于所述PEG為異型雙功能試劑，以PEG分子為骨架，結(jié)構(gòu)式為NH2-PEG-R, PEG分子的一端為氨基，PEG分子的另一端(R)為能與巰基反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，其中，優(yōu)選的R基團(tuán)為馬來(lái)酰亞胺酯。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗，以不含PEG的異型雙功能試劑為連接橋連接腦膜炎莢膜 多糖和載體蛋白，不含PEG的異型雙功能試劑的結(jié)構(gòu)式為NH2-R1-R2，一端為氨基，另一端(R2 )為能與巰基反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，其中，優(yōu)選的R2基團(tuán)為馬來(lái)酰亞胺酯。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的不含PEG的異型雙功能試劑NH2-R1-R2，Rl為碳數(shù)為1_10的烷基，優(yōu)選的異型雙功能試劑為N-2-胺乙基-馬來(lái)酰亞胺。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗，所用的腦膜炎莢膜多糖為A群、B群、C群、W135群和Y群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗，所用的載體蛋白包括但不限于破傷風(fēng)類毒素、CRM197、白喉類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、外毒素A、外膜復(fù)合物C、孔蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌粘附素蛋白質(zhì)、卵...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：胡濤，安文琪，蘇志國(guó)，范蓓，黃慶瑞，馬小偉，潘若文，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所，華蘭生物工程股份有限公司，華蘭生物疫苗有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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