本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種涂覆有Matrigel的細胞培養(yǎng)板及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明專利技術(shù)采用先進的等離子噴涂技術(shù)在細胞培養(yǎng)板表面形成羧基表面，然后采用化學(xué)鉚釘技術(shù)將Matrigel通過共價鍵的形式連接到聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿表面，形成涂覆有Matrigel的細胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿。由于該培養(yǎng)板的基材表面采用化學(xué)相結(jié)合的表面處理方式，其表面的Matrigel不會溶出。相該培養(yǎng)板比于通過物理包被的細胞培養(yǎng)板，該培養(yǎng)板的保存時間更長。該培養(yǎng)板（皿）適用于原代細胞及少數(shù)貼壁困難，易成團，易脫落，生長緩慢的細胞的培養(yǎng)，如神經(jīng)元、LNCaP、PC-12等，可使細胞貼壁更加牢固，細胞伸展充分，獲得更穩(wěn)定生長狀態(tài)。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種涂覆有Matrigel的細胞培養(yǎng)板及其制備方法和在細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用，屬于細胞培養(yǎng)
技術(shù)介紹
細胞培養(yǎng)是生物學(xué)科學(xué)研究、細胞治療以及組織工程發(fā)展的必要前提，細胞培養(yǎng)板(皿)是細胞培養(yǎng)的基本裝置，目前用于細胞培養(yǎng)板主要由聚苯乙烯或聚乙烯加工而成，適合于多種細胞的粘附和生長。隨著細胞生物學(xué)的發(fā)展，對細胞培養(yǎng)板的性能要求也越來越高，普通的細胞培養(yǎng)板對一些原代細胞及貼壁困難，易成團，易脫落，生長緩慢的細胞擴增的效果不佳。為了改善這些細胞的粘附和增殖情況，近年來，人們通過物理的方法將聚賴氨酸、膠原等生物相容性良好的材料涂覆在細胞板表面以促進細胞的粘附和增殖。例如 聚賴氨酸包被的表面可以改善細胞的貼附性和加快增殖，適用于無血清或低血清培養(yǎng)或神經(jīng)元細胞培養(yǎng)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染細胞系培養(yǎng)(如HEK-293、PC12、L929、3T3細胞系)。膠原蛋白包被細胞培養(yǎng)板可以大幅度降低蛋白質(zhì)的吸附。在該培養(yǎng)板上進行播種后，只要靜置即可獲得細胞的貼壁和增殖。可以抑制細胞的培養(yǎng)面因此，細胞的聚集的成型率高，所培養(yǎng)的細胞形態(tài)均一。近年來，Matrigel也被廣泛的應(yīng)用于細胞分化、血管形成和腫瘤生長有關(guān)的研究，美國專利US20030017589中采用matrigel涂覆的培養(yǎng)板用于培養(yǎng)胚胎干細胞。但是這些方法均存在操作復(fù)雜以及涂覆不均一的缺點。本專利技術(shù)旨在公開一種涂覆有Matrigel的細胞培養(yǎng)板及其制備方法，采用化學(xué)交聯(lián)將Matrigel均一地固定在細胞培養(yǎng)板表面，用以多種細胞特別是神經(jīng)類細胞的培養(yǎng)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種用于細胞培養(yǎng)的涂覆有Matrigel的細胞培養(yǎng)板及其制備方法，以該方法制得細胞培養(yǎng)板表面涂覆有生物相容性良好的Matrigel。 本專利技術(shù)是通過下述技術(shù)方案加以實現(xiàn),一種用于細胞培養(yǎng)的涂覆有Matrigel的細胞培養(yǎng)板，其特征在于，細胞培養(yǎng)板表面Matrigel的密度0.01-2mg/cm2。在本專利技術(shù)中，Matrigel是通過共價鍵的方式與聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板表面連接,相比于物理涂覆具有更好的穩(wěn)定性和均一性。上述的用于細胞培養(yǎng)的涂覆有Matrigel的細胞培養(yǎng)板的制備方法及由該方法制備得的細胞培養(yǎng)板，其特征在于包括以下過程:(I)將聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿在無水乙醇中浸泡40min，用去離子水沖洗，真空干燥，備用；(2)量取50ml去離子水，將0.05-0.2g羥基琥珀酰亞胺(NHS)以及0.5g2_嗎啉乙磺酸水合物(MES)加入其中，混合攪拌30min-lh，過濾滅菌，并保存在4°C中備用；(3)稱取一定量的碳化二亞胺(EDC)溶于去離子水中，形成質(zhì)量濃度為1-5%的碳化二亞胺溶液，過濾滅菌備用；(4)將清洗好的培養(yǎng)板放入等離子發(fā)生器中，抽真空至Ο-lPa，通入氧氣至10-200Pa，調(diào)整放電功率在5-300W之間，進行射頻放電0.5-10min ；(5)在真空狀態(tài)下將步驟(2)配制的混合液加入到步驟(4)獲得的培養(yǎng)板中，液面要完全覆蓋培養(yǎng)板底部，IOmin后將一定體積的蛋白濃度為9_15mg/ml Matrigel溶液加入其中，混合均勻孵育30min ;最后在混合液中加入步驟(3)獲得的碳化二亞胺溶液，混合均勻后孵育30min以上；(6)棄去步驟(5)獲得的培養(yǎng)板中的混合液體，并用無菌去離子水沖洗3遍，干燥，封裝，即得。進一步的，本專利技術(shù)還提出了所述的涂覆有Matrigel的細胞培養(yǎng)板在細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。其中，優(yōu)選的，所述的細胞為原代細胞及少數(shù)貼壁困難，易成團，易脫落，生長緩慢的細胞，如神經(jīng)元、LNCaP、PC-12等。 本專利技術(shù)的有益效果:本專利技術(shù)采用先進的等離子噴涂技術(shù)在細胞培養(yǎng)板表面形成羧基表面，然后采用化學(xué)鉚釘技術(shù)將Matrigel通過共價鍵的形式連接到聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿表面，形成涂覆有Matrigel的細胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿。由于該培養(yǎng)板的基材表面采用化學(xué)相結(jié)合的表面處理方式，其表面的Matrigel不會溶出。相該培養(yǎng)板比于通過物理包被的細胞培養(yǎng)板，該培養(yǎng)板的保存時間更長。該培養(yǎng)板(皿)適用于原代細胞及少數(shù)貼壁困難，易成團，易脫落，生長緩慢的細胞的培養(yǎng)，如神經(jīng)元、LNCaP、PC-12等，可使細胞貼壁更加牢固，細胞伸展充分，獲得更穩(wěn)定生長狀態(tài)。用該方法獲得的細胞培養(yǎng)板能夠促進神經(jīng)元的生長并形成突起。如圖1所示，培養(yǎng)3天時，在Matrigel膠涂覆的細胞培養(yǎng)板上種植的神經(jīng)元，生長良好表現(xiàn)出神經(jīng)元特有的突起，而在普通培養(yǎng)板上生長的神經(jīng)元則呈現(xiàn)球形，沒有突起形成(如圖2所示)。該方法過程簡單且獲得的培養(yǎng)板表面的Matrigel均一穩(wěn)定，能夠促進多種細胞的增殖(神經(jīng)細胞、心肌細胞、干細胞等)。成本相對低廉，應(yīng)用更加安全。附圖說明圖1為神經(jīng)元在Matrigel涂覆的細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)3時的光鏡照片；圖2為神經(jīng)元在普通培養(yǎng)板上培養(yǎng)3時的光鏡照片。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本專利技術(shù)，本專利技術(shù)的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本專利技術(shù)的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本專利技術(shù)的精神和范圍下可以對本專利技術(shù)技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本專利技術(shù)的保護范圍內(nèi)。實施所用的主要原料Matrigel為自制或購自BD公司(貨號:354234)，EDC、NHS以及MES等均為化學(xué)純。實施例1涂覆有Matrigel的細胞培養(yǎng)板的制備(I)將聚苯乙烯6孔細胞培養(yǎng)板在無水乙醇中浸泡40min，用去離子水沖洗，真空干燥，備用。(2)量取50ml去離子水，將0.2g羥基琥珀酰亞胺(NHS)以及0.5g2_嗎啉乙磺酸水合物(MES)加入其中，混合攪拌半小時以上，過濾滅菌，并保存在4°C中備用。(3)稱取Ig碳化二亞胺(EDC)溶于99ml去離子水中，形成質(zhì)量濃度為1%的EDC溶液，過濾滅菌備用。(4)將清洗好的培養(yǎng)板放入等離子發(fā)生器中，抽真空至IPa，通入氧氣至50Pa，調(diào)整放電功率在60W，進行射頻放電Imin。(5)在真空狀態(tài)下將步驟(4)獲得的培養(yǎng)板中，每孔加入步驟(2)配制的混合液3ml, IOmin后將然后將3ml自制的蛋白濃度為15mg/ml的Matrigel溶液(按照實施例5的方法制備得到)加入其中，混合均勻孵育30min，再在每孔中加入2ml步驟(3)獲得的EDC溶液，孵育30min。(6)棄去步驟(5)獲得的培養(yǎng)板中的混合液體，并用無菌去離子水沖洗3遍，干燥，封裝，用于細胞培養(yǎng)。實施例2涂覆有Matrigel的細胞培養(yǎng)板的制備(I)將聚苯乙烯6孔細胞培養(yǎng)板在無水乙醇中浸泡40min，用去離子水沖洗，真空干燥，備用。(2)量取50ml去離子水，將0.1g羥基琥珀酰亞胺(NHS)以及0.5g2_嗎啉乙磺酸水合物(MES)加入其中，混合攪拌半小時以上，過濾滅菌，并保存在4°C中備用。(3)稱取5g碳化二亞 胺(EDC)溶于95ml去離子水中，形成質(zhì)量濃度為5%的EDC溶液，過濾滅菌備用。(4)將清洗好的培養(yǎng)板放入等離子發(fā)生器中，抽真空至0.5Pa，通入氧氣至lOOPa，調(diào)整放電功率在100W，進行射頻放電lmin。(5)在真空狀態(tài)下將步驟(4)獲得的培養(yǎng)板中，每孔加入步驟(2)配制的混合液3m本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種涂覆有Matrigel的細胞培養(yǎng)板，其特征在于，在聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板表面涂覆0.01?2mg/cm2的Matrigel。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種涂覆有Matrigel的細胞培養(yǎng)板，其特征在于，在聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板表面涂覆0.01-2mg/cm2 的 Matrigel。2.按權(quán)利要求1所述的細胞培養(yǎng)板，其特征在于按照以下方法制備得到: (1)將聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿在無水乙醇中浸泡40min，用去離子水沖洗，真空干燥，備用； (2)量取50ml去離子水，將0.05-0.2g羥基琥珀酰亞胺(NHS)以及0.5g2_嗎啉乙磺酸水合物(MES)加入其中，混合攪拌30min-lh，過濾滅菌，并保存在4°C中備用； (3)稱取一定量的碳化二亞胺(EDC)溶于去離子水中，形成質(zhì)量濃度為1-5%的碳化二亞胺溶液，過濾滅菌備用； (4)將清洗好的培養(yǎng)板放入等離子發(fā)生器中，抽真空至Ο-lPa，通入氧氣至10-200Pa，調(diào)整放電功率在5-300W，進行射頻放電0.5-10min ； (5)在真空狀態(tài)下將步驟(2)配制的混合液加入到步驟(4)獲得的培養(yǎng)板中，液面要完全覆蓋培養(yǎng)板底部，IOmin后將一定體積的蛋白濃度為9_15mg/ml Matrigel溶液加入其中，混合均勻孵育30min ;最后在混合液中加入步驟(3)獲得的碳化二亞胺溶液，混合均勻后鮮育30min以上； (6)棄去步驟(5)獲得的培養(yǎng)板中的混合液體，并用無菌去離子水沖洗3遍，干燥，封裝，即得。3.一種制備權(quán)利要求1或2所述的涂覆有Matrigel的細胞...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李萌，
申請(專利權(quán))人：黑龍江省重生生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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