本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種靶向MITF基因的雙鏈siRNA分子及其在美白祛斑化妝品或制備治療黑色素基因相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。該siRNA分子正義鏈為SEQIDNO:3，反義鏈為SEQIDNO:4，其中，反義鏈可特異性地與MITF基因的mRNA結(jié)合，降解mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，達(dá)到降低黑色素的目的。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種siRNA分子及其應(yīng)用，尤其是抑制黑色素生成的siRNA分子及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
小眼 畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associatedtranscription factor,MITF)，又稱小眼球相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在黑色素細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)上起著重要作用。MITF具有基本-螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈(basic-helix-loop-helix-leucine zipper,bHLHZip)結(jié)構(gòu)(Hodgkinson CA 等，1993, Cell, 744:395_404)。人類的 MITF 基因定位于人類第三條染色體3P141-3P12 3。研究證實(shí)其在色素細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。MITF基因突變導(dǎo)致色素細(xì)胞的發(fā)育缺陷與功能障礙，同時(shí)MITF與其他信號(hào)分子發(fā)生復(fù)雜的相互作用。MITF可調(diào)控酪氨酸基因家族的表達(dá)，從而參與黑素生成的調(diào)控(Shibahara，S等，Pigment Cell Res，1998，11:329_336)。酪氨酸酶基因家族的三個(gè)成員:酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1 (TRP-1)，酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2 (TRP-2)，基因的啟動(dòng)子都含有一個(gè)“M box”的結(jié)構(gòu)，M box的核心結(jié)構(gòu)為“CATGTG”，MITF可以與該結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而反式激活相應(yīng)的基因表達(dá)。MITF通過與酪氨酸酶基因家族啟動(dòng)子的作用，一方面指導(dǎo)它們?cè)诤谒丶?xì)胞中特異性表達(dá)，另一方面參與外界刺激對(duì)黑素細(xì)胞黑素生成的調(diào)控。根據(jù)人酪氨酸基因缺失和突變分析，發(fā)現(xiàn)在酪氨酸啟動(dòng)子有三個(gè)結(jié)構(gòu):TDE、M box和E box，這三個(gè)結(jié)構(gòu)均含有“CATGTG”核心模色，它們對(duì)于酪氨酸在色素細(xì)胞中有效表達(dá)是必須的，而在非色素細(xì)胞中具有同樣結(jié)構(gòu)的啟動(dòng)子僅有微弱表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MITF與這些結(jié)構(gòu)結(jié)合，刺激啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。MITF本身也具有細(xì)胞特異性，MITF在酪氨酸酶的黑素細(xì)胞特異性表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。TRP-1和TRP-2也具有M-box結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在酪氨酸家族高度保守，MITF可與TRP-1基因M-box結(jié)合而活化其表達(dá)，并指導(dǎo)其在黑素細(xì)胞中特異性表達(dá)。(Aksan I等，Mol CellBiol,1998，18(12):6930_8)。黑色素細(xì)胞是皮膚的重要組成細(xì)胞之一，起源于胚胎神經(jīng)嵴，具有樹狀突起，屬于腺細(xì)胞，合成的黑素經(jīng)由樹狀突起分泌進(jìn)入角質(zhì)形成細(xì)胞，隨角質(zhì)形成細(xì)胞的脫落而排出體外，存在于表皮基底層。黑色素細(xì)胞通過合成黑色素形成皮膚顏色，同時(shí)可吸收紫外線，使機(jī)體免遭紫外線的損害。哺乳動(dòng)物皮膚和毛發(fā)的顏色主要是由黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的黑色素的相對(duì)數(shù)量和分布情況決定的(Sturm RA等，Bioessays, 1998, 20:712)0黑色素又分為真黑色素(Eu-melanin)(棕/黑)和假黑色素(Pheo-melanin)(紅/黃色)(Newton JM等,Mamma Genome, 2000,11:24)。黑色素細(xì)胞的發(fā)育、分化與黑色素的合成調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中有多種信號(hào)分子參與該過程的調(diào)控，構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，其中MITF在其中扮演重要的角色。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是生物界中一種既古老且在進(jìn)化上又高度保守的現(xiàn)象，是由雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的基因轉(zhuǎn)錄后沉默(Andrew Fire 等，Nature，1998，391:806_811)。小干擾 RNA (siRNA)是RNAi的效應(yīng)分子，由兩條互補(bǔ)的RNA單鏈構(gòu)成，長(zhǎng)2廣23個(gè)核苷酸(nt)。由于RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以技術(shù)廣泛地應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究、傳染性疾病以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。有研究報(bào)道，通過RNAi調(diào)節(jié)抑制MITF基因，可以調(diào)控下游酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因和酪氨酸酶相關(guān)蛋白I (tyrosinase relatedprotein-1，TRP-1)基因(Busca B 等，J Cell Biol，2005，49)，從而調(diào)控黑色素的生成。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的 目的在于提供一種通過siRNA分子庫技術(shù)篩選出的高效靶向MITF基因的雙鏈siRNA分子，其下述正義鏈和反義鏈組成: 正義鏈:5’-GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGANn-3’ (SEQ ID NO: 3) 反義鏈:5’ -UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCCNn-3’ (SEQ ID NO: 4) 其中，N為胞嘧啶核苷C、鳥嘌呤核苷G、腺嘌呤核苷A、尿嘧啶核苷U ;脫氧胞嘧啶核苷dC、脫氧鳥嘌呤核苷dG、脫氧腺嘌呤核苷dA或脫氧胸腺嘧啶核苷dT。換句話說，該雙鏈siRNA分子的主干序列為: 正義鏈:5’ -GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGA-3’(SEQ ID NO: 5) 反義鏈:5’ -UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCC-3’(SEQ ID NO: 6) 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述序列中3’端的“Nn”是兩個(gè)脫氧胸腺嘧啶dTdT。本專利技術(shù)的另一目的在于提供上述siRNA分子在制備美白祛斑化妝品和治療高黑色素相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。本專利技術(shù)針對(duì)參與黑色素形成調(diào)控的MITF基因的構(gòu)建siRNA分子庫，通過高通量篩選的方法篩選出能有效抑制黑色素生成的siRNA，通過RNAi調(diào)節(jié)抑制MITF基因，從而調(diào)控黑色素的生成。本專利技術(shù)篩選到的靶向MITF基因的siRNA可以作為藥物制劑或化妝品的一種有效成份，用于下調(diào)皮膚中黑色素基因的表達(dá)，以減少色素的含量和沉著，祛除皮膚上的斑點(diǎn)，如老年斑、痘印、色素斑、雀斑、妊娠斑或其它由陽光、炎癥、藥物等因素引起的色素變化，從而使人體肌膚變白。體外實(shí)驗(yàn)證明，本專利技術(shù)的SiRNA分子的反義鏈可特異性地與MITF基因的mRNA結(jié)合，降解mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，下調(diào)黑色素相關(guān)基因的表達(dá)，最終抑制黑色素的生成，無明顯毒副作用。附圖說明圖1是合成的MITF基因保守區(qū)開放閱讀框瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖，制備得到的DNA片段大小為1563bp。左側(cè)條帶是DNA分子量Marker (標(biāo)準(zhǔn)參照)。圖2是siRNA分子庫構(gòu)建流程示意圖。圖3是“U6_siRNA轉(zhuǎn)錄模板-H1”表達(dá)框結(jié)構(gòu)示意圖。圖4是PCR制備的“U6_siRNA轉(zhuǎn)錄模板-H1”表達(dá)框純化后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖(部分)。圖中，最右側(cè)條帶是DNA分子量Marker (標(biāo)準(zhǔn)參照)。圖5是“U6_siRNA轉(zhuǎn)錄模板-H1”表達(dá)框轉(zhuǎn)染細(xì)胞后實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MITF基因的mRNA表達(dá)量柱形圖，橫坐標(biāo)表示各處理實(shí)驗(yàn)組,縱坐標(biāo)表示MITF相對(duì)于GAPDH的mRNA表達(dá)水平，其中箭頭所指是M001-24轉(zhuǎn)染組，“正常組”為正常培養(yǎng)細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組。圖6是化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MITF基因的mRNA表達(dá)量柱形圖，橫坐標(biāo)表示各處理實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示MITF相對(duì)于GAPDH的mRNA表達(dá)水平，其中M001-24為M001-24轉(zhuǎn)染組，“正常組”為正常培養(yǎng)細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組，“陰性對(duì)照組”為陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組。圖7是siRNA轉(zhuǎn)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種雙鏈siRNA分子，其具有如下序列結(jié)構(gòu)：正義鏈：5’?GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGANn?3’??????（SEQ?ID?NO:?3）反義鏈：5’?UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCCNn?3’???????（SEQ?ID?NO:?4），其中，N為脫氧胸腺嘧啶核苷dT；n為0或2。
【技術(shù)特征摘要】
1.種雙鏈SiRNA分子，其具有如下序列結(jié)構(gòu):正義鏈:5’ -GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGANn-3’(SEQ ID NO: 3)反義鏈:5’ -UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCCNn-...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱遠(yuǎn)源，李鐵軍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江蘇吉康生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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