本發明專利技術公開了一種座囊霉菌突變株及其催化生產樺木酮醇的方法，該突變株為座囊霉菌（Dothideomycete?sp.）UV?14，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號：CCTCC?NO.M?2012523。生產樺木酮醇的方法包括如下步驟：座囊霉菌經活化后，接種至含有氯化鈉的土豆葡萄糖液體培養基中，培養1~3天；加入樺木醇和二甲基亞砜后，反應12~60小時過濾，濾液用乙酸乙酯萃取；過濾所得菌體經凍干后，加入乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有機相，在真空下除去溶劑，經柱層析后，得到產物樺木酮醇。本發明專利技術具有區域選擇性高、反應條件溫和、環境友好、轉化效率高，反應時間短、目的產物收率高等優點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于天然產物及應用生物催化領域，具體涉及一種座囊霉菌突變株及其催化樺木醇區域選擇性氧化制備樺木酮醇的方法。
技術介紹
樺木醇是一種羽扇烷類五環三萜化合物，具有抗炎及抗病毒等活性，并且顯示出與其它藥物不同的作用機制，對腫瘤細胞也具有一定的毒性(林產化學與工業，2009，29(1)，87)，但較低的生物活性及選擇性等阻礙了其在臨床上的應用。為此，以樺木醇為先導化合物，對其進行結構修飾以提高其生物活性成為了近年來的研究熱點(Natural Product Reports, 2006，23，394)。樺木酮醇是樺木醇3-輕基氧化后的羰基衍生物。大量研究表明，樺木酮醇的生物活性遠高于樺木醇。例如，樺木酮醇對肺癌NSCLC-N6細胞的毒性遠高于樣木醇(Phytochemistry, 2004, 65, 1159);樣木醇的3-輕基經氧化修飾后，明顯增強了其誘導小鼠黑素瘤細胞分化活性(Journal of NaturalProducts, 2002，65，645)。同時樺木酮醇也是制備具有重要應用價值的異構樺木酮醇(allobetulone)的關鍵合成砲塊(Molecules, 2011, 16, 2443)。盡管許多植物如大柄冬青(Ilex macropoda)及紅樹林植物瓶花木(ScyphiphorahydrophylIacea)等中均含有樺木酮醇(熱帶亞熱帶植物學報，2007, 15(3)，249;Archivesof Pharmacal Research, 2002, 25，617)，但含量甚低，極大地限制了該化合物的研究與應用。因此，必須開發簡便的制備樺木酮醇的新技術及新工藝。樺木醇是樺木酮醇的生物合成前提物，在植物中含量較高，尤其是在白樺樹皮中其含量高達25%。故以廉價、易得的樺木醇為原料，通過化學/生物催化法制備樺木酮醇是一條極具應用潛力的合成路線。在樺木醇分子中有三個活性官能團(3-羥基，28-羥基及C2tl-C29雙鍵)，由于化學法的選擇性較差，故如想對其中的3-羥基進行選擇性氧化修飾時，通常需要繁瑣的保護及脫保護步驟，并且通常 需要使用化學計量的、環境不友好的氧化劑CrO3和KMnO4等。盡管利用生物催化與生物轉化手段能有效避免化學法的上述缺點，但28-羥基為伯羥基，而3-羥基為仲羥基，前者空間位阻相對較小，故前者通常比后者活潑，更易被修飾。事實上，目前已報道的生物催化劑也只能催化28-羥基氧化及環上其他位點的羥基化反應(ProcessBiochemistry 2011, 46:1-15;Enzyme and Microbial Technology, 2009, 45:175-180; Journal of Applied Microbiology, 2011，110:90-97),仍無法實現低活性的 3-輕基的區域選擇性氧化。最近，我們篩選到一株能區域選擇性催化樺木醇3-羥基氧化合成樺木酮醇的座囊霉菌HQ 316564,在最適條件下，產率為43%(Journal of Molecular CatalysisB:Enzymatic, 2013，88:32-35)。但以該原始菌株為生物催化劑，轉化效率較低、反應時間較長(需預培養菌株3天，加入底物后反應6天)，并且產率不高。
技術實現思路
針對現有技術存在的問題，利用紫外隨機突變技術對原始菌株座囊霉菌Dothideomycete sp.HQ 316564進行誘變,篩選獲得一株高效催化催化樺木醇區域選擇性氧化合成樺木酮醇的突變株。本專利技術的目的在于提供該座囊霉菌突變株及其催化樺木醇區域選擇性氧化合成樺木酮醇的方法。本專利技術的目的通過以下技術方案實現:一種座囊霉菌突變株，該突變株為座囊霉菌(Dothideomycete sp.)UV 14，于2012年12月11日，保藏于中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏號:CCTCC N0.M 2012523，保藏地址:武漢，武漢大學。該突變株的菌落形態如圖2 (b)所示。利用上述座囊霉菌催化生產樺木酮醇的方法，包括如下步驟:(I)座囊霉菌(Dothideomycete sp.) UV 14經活化后,在生理鹽水中配置濃度為IXio7個孢子/mL的種子液，接種至含氯化鈉的土豆葡萄糖液體培養基中，培養廣3天；(2)加入底物樺木醇和助溶劑二甲基亞砜后，調節培養基的pH至5.(T9.0,在23^380CU60r/min下反應12飛O小時后，過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取三次(等體積是指與濾液體積相等)；過濾所得菌體經凍干后，加入1/2濾液體積的乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有機相，在真空下除去溶劑，經柱層析后，得到產物樺木酮醇。優選地,步驟(I)所述座囊霉菌(Dothideomycete sp.) UV 14的活化是在含氯化鈉的PH 7.0的土豆葡萄糖瓊脂培養基上，于28° C下活化6天。優選地，所述含氯化鈉的土豆葡萄糖瓊脂培養基的配方為:2%葡萄糖，20% 土豆、1.5%瓊脂和0.3%氯化鈉。優選地，步驟(I)所述種子液的接種量為1%。優選地，步驟(I)所述含氯化鈉的土豆葡萄糖液體培養基的配方為:2%葡萄糖，20% 土豆和0.3%氯化鈉。 優選地，步驟(I)所述培養條件為初始pH 5.(Γ7.0、23 38°C、14(Tl80r/min。優選地，步驟(2)所述二甲基亞砜的濃度為0.2 1.0% (v/v)0優選地，步驟(2)所述樺木醇的濃度為100mg/L。本專利技術與現有的技術相比，具有如下的優點:I)利用座囊霉菌Dothideomycete sp.UV14細胞作為催化劑能高區域選擇性地催化樺木醇中空間位阻較高、活性較低的3-位仲羥基氧化。2)以座囊霉菌Dothideomycete sp.UV14細胞作為催化劑合成樺木酮醇，與原始菌株Dothideomycete sp.相比，具有生物催化效率高、反應時間短、目的產物收率高等優點。3)本專利技術方法區域選擇性高、工藝簡單，避免了費時耗力的保護與脫保護步驟，并且具有反應條件溫和、環境友好的優點。附圖說明圖1為樺木醇轉化為樺木酮醇的反應式。圖2 為原始菌 Dothideomycete sp.HQ 316564(a)及突變株(Dothideomycetesp.)UV 14 (b)在3%氯化鈉、pH 7.0的土豆葡萄糖瓊脂培養基中，于28。C下培養3天后的菌落形態。圖3為樺木醇及樺木酮醇分析的典型液相色譜圖(樺木醇及樺木酮醇的保留時間分別為 10.09 及 11.98min)。具體實施例方式通過實施例進一步說明本專利技術，但不局限于實施例。實施例1座囊霉菌(Dothideomycete sp.)UV 14在含氯化鈉、pH 7.0的土豆葡萄糖瓊脂培養基(2%葡萄糖，20% 土豆，1.5%瓊脂，0.3%氯化鈉)上，于28° C下活化6天后，在生理鹽水中配置種子液(I X IO7個孢子/mL)，按1%的接種量接種至50mL含氯化鈉、pH 6.0的土豆葡萄糖液體培養基(2%葡萄糖，20% 土豆，0.3%氯化鈉)中，在28° C、160r/min下培養3天；隨后加入5mg樺木醇和0.4%(v/v)二甲基亞砜,調節培養基pH至6.0,在33° C、160r/min下反應；48本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種座囊霉菌突變株，其特征在于，該突變株為座囊霉菌（Dothideomycete?sp.）UV?14，于2012年12月11日，保藏于中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏號：CCTCC?NO.M?2012523。
【技術特征摘要】
1.一種座囊霉菌突變株，其特征在于，該突變株為座囊霉菌(Dothideomycete sp.)UV 14，于2012年12月11日，保藏于中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏號=CCTCCN0.M 2012523。2.利用權利要求1所述座囊霉菌催化生產樺木酮醇的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)座囊霉菌(Dothideomycetesp.)UV 14經活化后，在生理鹽水中配置濃度為I X IO7個孢子/mL的種子液，接種至含有氯化鈉的土豆葡萄糖液體培養基中，培養f 3天； (2)加入底物樺木醇和助溶劑二甲基亞砜后，調節培養基的pH至5.(T9.0，在23 38°C、160r/min下反應12飛O小時后，過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取三次；過濾所得菌體經凍干后，加入1/2濾液體積的乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有機相，在真空下除去溶齊U，經柱層析后，得到產物樺木酮醇。3.根據權利要求2所述的方法,其特征在于,步驟(I)所述座囊...
【專利技術屬性】
技術研發人員：宗敏華，李寧，胡瑩丹，
申請(專利權)人：華南理工大學，
類型：發明
國別省市：廣東;44
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