一種表達豬小腸三葉因子的重組嗜酸乳桿菌的構建方法及用途技術

本發明專利技術公開了一種表達豬小腸三葉因子基因的重組嗜酸乳桿菌的構建方法及用途，根據已公開的豬小腸三葉因子的基因序列及表達載體質粒特點，設計含特異酶切位點的引物；以豬小腸黏膜為材料，通過RT-PCR獲得含有豬小腸三葉因子基因的片段，將其與乳酸菌表達載體質粒pMG36e進行連接，獲得重組質粒pMG36e-itf3，通過電轉化方法將該重組質粒轉入嗜酸乳桿菌內，得到表達豬小腸三葉因子的重組嗜酸乳桿菌，在乳鏈菌肽(nisin)的誘導下進行表達，并經SDS-PAGE和Western?blot分析證明目的基因得到正確表達。該重組菌用于防治腹瀉的發生，改善豬的腸道健康，提高生長性能。

【技術實現步驟摘要】

【技術保護點】
一種表達豬小腸三葉因子基因的重組嗜酸乳桿菌的構建方法，其特征在于包括以下步驟：（1）豬小腸三葉因子基因的獲得：提取豬小腸黏膜RNA，經過反轉錄得到cDNA，以此cDNA為模板，設計合成含有Xma?I和Sph?I酶切位點的上下游引物P1和P2，上下游引物P1和P2分別具有豬itf3基因（Gene?ID：?AM283538.1）的序列，采用PCR方法擴增豬itf3基因片段。將所擴增的itf3目的基因片段與克隆載體pMD18T載體連接，得到重組質粒，轉入大腸桿菌DH5a中，經過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆，并通過酶切鑒定和測序分析驗證，驗證正確的質粒命名為pMD18T?itf3，重組質粒序列測定表明該質粒具有豬itf3的基因序列。（2）重組表達載體pMG36e?itf3的構建：將乳酸菌表達載體pMG36e和克隆質粒pMD18T?itf3用限制性內切酶Xma?I和Sph?I進行雙酶切，純化回收雙酶切的線性化的pMG36e載體片段和itf3目的基因片段，并將線性化的載體片段和目的基因片段進行連接，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞中，通過紅霉素抗性篩選，挑取陽性克隆，提取重組質粒，酶切鑒定正確后，命名為pMG36e?itf3，其具有豬itf3的基因序列。（3）表達豬小腸三葉因子的重組嗜酸乳桿菌的構建：采用電轉化方法將重組質粒pMG36e?itf3轉化入嗜酸乳桿菌NZ6092感受態細胞中，利用紅霉素抗性進行篩選，得到重組菌，命名為：NZ6092?itf3。（4）豬小腸三葉因子在嗜酸乳桿菌中的誘導表達及SDS、Western?Blot分析：挑取重組菌NZ6092?itf3接種于含有100ug/mL紅霉素的MRS液體培養基中，誘導表達。得到大小為8Kda左右的蛋白條帶。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：侯永清，吳濤，竇茂鑫，趙迪，丁斌鷹，
申請(專利權)人：武漢工業學院，
類型：發明
國別省市：