本發明專利技術涉及一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，包括：FA連接到NH2-PEG-COOH上形成COOH-PEG-FA；水熱法合成PEI包覆的Fe3O4納米顆粒（Fe3O4-PEI）；Fe3O4-PEI納米顆粒表面修飾異硫氰酸熒光素(FI)；COOH-PEG-FA連接到Fe3O4納米顆粒的表面；最后對Fe3O4納米顆粒表面PEI剩余氨基進行乙酰化修飾以增加其生物相容性，用于MRI成像診斷。本發明專利技術工藝簡單，反應條件溫和，易于操作；制備的Fe3O4磁性納米顆粒具有良好的膠體穩定性、生物相容性和腫瘤靶向性，在體內腫瘤靶向診斷領域具有潛在的應用價值。
【技術實現步驟摘要】
基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法
本專利技術屬于核磁共振成像造影劑的制備領域，特別涉及一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法。
技術介紹
一直以來，惡性腫瘤都是危害人類生命的頭號殺手，具有死亡率高、難治療以及惡化迅速等特點。因此，腫瘤的早期診斷和特異性治療顯得尤為重要。目前，腫瘤的檢測手段各種各樣，主要有:超聲成像、CT成像、核醫學PET成像以及核磁共振成像(MRI)。隨著核磁共振技術的發展，其掃描時間逐漸縮短，分辨率逐漸提高，對于小病灶的檢測也更加準確，這也使得核磁共振成像技術成為近幾年發展起來的新型疾病檢測手段。為了提高MRI成像診斷的靈敏度和特異性，有必要選擇合適的MRI造影劑。常規的MRI造影劑主要分為兩類:一類是T1加權的MRI造影劑，一類是T2加權的MRI造影劑。T1加權的MRI造影劑主要是Gd基配合物，然而，Gd為重金屬元素，小分子Gd試劑在體內停留時間過短，其臨床注射劑量較大，且Gd試劑具有很強的腎毒性，特別是對腎功能不全患者危害尤甚。而T2加權的MRI造影劑主要是超順磁Fe3O4為代表的金屬鐵氧化物納米粒子，超順磁性氧化鐵具有獨特的磁學性質以及信號強、使用劑量低和好的生物相容性等特點使其成為核磁共振成像的良好造影劑。作為生物體內MRI造影劑，Fe3O4納米顆粒必須具有良好的水溶性、穩定性、生物相容性、和較高的T2弛豫率。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)是一種水溶性聚胺，其大分子鏈上擁有大量的氨基，不僅為磁性Fe3O4納米顆粒提供了穩定存在的屏障，并且使納米Fe3O4顆粒表面帶上了正電荷和功能性基團，這就為Fe3O4納米顆粒的表面多功能修飾提供了可行性(Cai et al., ACS Appl.Mater.1nterfaces2013, DO1:10.1021/am302883m;專利公開號 201210277624.9)。聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)是高親水性聚合物，它對納米顆粒的修飾可以提高納米顆粒的水溶性和生物相容性，并延長其在體內的血液循環時間(Peng et al., Biomaterials2012, 33, 1107-1119 ；ffen et al., Biomaterials2013, 34, 1570-1580)。葉酸作為一種靶向分子，具有分子量小、無毒、無免疫原性、生物相容性好、穩定性高、廉價易得、易于修飾等多種優勢(Shi et al., AdvancedMaterials2008, 20，1671-1678)`。本課題組前期的專利(專利公開號201210277624.9)成果顯示聚乙烯亞胺(PEI)修飾的磁性氧化鐵納米顆粒可以通過簡易的水熱法合成。本專利技術采用相同的方法合成了具有良好膠體穩定性的PEI包覆的Fe3O4納米顆粒。隨后，Fe3O4納米顆粒表面的PEG-FA修飾不僅增加了納米顆粒的水溶性和生物相容性，為進一步的體內成像應用提供了保障；同時也提高了 Fe3O4納米顆粒對腫瘤細胞或腫瘤部位的靶向性，從而使核磁共振成像診斷更加準確、靈敏。檢索國內外文獻，尚沒有發現關于用一步水熱合成法制備PEI包覆和FA修飾的Fe3O4納米顆粒及其用于體內腫瘤模型靶向MRI研究的相關報道。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，該方法工藝簡單，反應條件溫和，易于操作，成本較低。制備的Fe3O4磁性納米顆粒能夠長時間穩定分散于水溶液中，不會出現團聚現象。所用的修飾劑PEI為廉價和環境友好材料，具有產業化實施的前景。本專利技術的一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，包括:(I)將亞鐵鹽溶解于超純水中，加入NH3 -H2O并于空氣氣氛下攪拌10 20分鐘，然后將混合溶液轉移到高壓反應釜中，并將0.lg/mL的超支化聚乙烯亞胺PEI水溶液也加入到高壓反應釜中，攪拌混合均勻后，于130 140°C反應2 4小時；反應結束后，自然冷卻至室溫，將沉淀磁分離洗滌純化后，即得PEI包裹的四氧化三鐵納米顆粒Fe3O4-PEI,產物儲存于4°C備用，取3mL真空冷凍干燥，干燥產物儲存于_20°C ；(2 )將FA溶解于DMSO中后，先用EDC和NHS活化2 4h，然后逐滴加入到NH2-PEg-COOH的DMSO溶液中，攪拌反應2 4天，透析(用截留分子量為1000的透析袋對蒸餾水透析三天(6次，2L/次))，除去副產物和雜質，然后真空冷凍干燥，即得C00H-PEG-FA，儲存在_20°C備用；(3)將步驟(I)中制備的Fe3O4-PEI納米顆粒用DMSO洗滌后，重新分散于DMSO中，再將DMSO溶解的FI溶液加入到上述Fe3O4-PEI的DMSO溶液中，攪拌反應I 3天后，產物Fe3O4-PE1-FI分離洗滌，然后分散到DMSO中，并儲存在4°C備用；(4)步驟(2 )中制備的C00H-PEG-FA以及EDC和NHS溶解于DMSO后，攪拌活化2 4h ;然后將活化的C00H-PEG-FA溶液加入到步驟(3)制備的Fe3O4-PE1-FI溶液中，攪拌反應2 4天，再分離洗滌，并分散于超純水中，得到Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒水溶液，并儲存在4 °C備用；(5)向步驟(4)制備的Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒水溶液中加入三乙胺，并攪拌20 40分鐘；然后向上述溶液中加入乙酸酐，繼續攪拌反應20 30小時；分離洗滌并分散于超純水中，即制得乙酰化的產物Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒，取ImL真空冷凍干燥后儲存于-20°C，余下4mL儲存于4°C備用。所述步驟(I)中的亞鐵鹽為FeCl2.4H20，亞鐵鹽、超純水、NH3.H2O的配比為I 1.5g:7.5 8.0mL:6. 0 6.5mL,優選1.25g:7.75mL:6.25mL ;亞鐵鹽與超支化聚乙烯亞胺PEI質量比為2 3:1，優選2.5:1。所述步驟(I)中的NH3.H2O質量百分比濃度為25-28%。所述步驟(I)中的超支化聚乙烯亞胺PEI的分子量為25000。所述步驟(2)中FA、EDC和NHS的摩爾比為1:0.5 1:0.5 1，優選1:0.9:0.9,FA和NH2-PEg-COOH的摩爾比為I 3:1，優選2:1。所述步驟(2)中NH2-PEg-COOH的分子量為2000。所述步驟(3)中FI與Fe3O4-PEI表面氨基的摩爾比為1:45 55，優選1:50。所述步驟(4)中的C00H-PEG-FA與EDC、NHS的摩爾比為1:4 6:4 6，優選1:5:5ο所述步驟(4)中的C00H-PEG-FA與Fe3O4納米顆粒表面氨基的摩爾比為1:4 6，優選1:5。所述步驟(5)中的三乙胺、乙酸酐與Fe3O4納米顆粒表面的PEI上伯氨基摩爾比為4 6:4 6:1,優選 5:5:1。本專利技術先利用一步水熱法合成PEI包裹的Fe3O4磁性納米顆粒，然后將FI和PEG-FA先后修飾在納米顆粒的表面，最后對納米顆粒的剩余表面氨基進行乙酰化修飾。本專利技術操作簡便易行，原材料成本低。制備的納米本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，包括：（1）將亞鐵鹽溶解于超純水中，加入NH3·H2O并于空氣氣氛下攪拌，然后將混合溶液轉移到高壓反應釜中，并將0.1g/mL的超支化聚乙烯亞胺PEI水溶液也加入到高壓反應釜中，攪拌混合均勻后，于130～140℃反應2～4小時；反應結束后，自然冷卻至室溫，將沉淀分離洗滌純化后，即得PEI包裹的四氧化三鐵納米顆粒Fe3O4?PEI；（2）將FA溶解于DMSO中后，先用EDC和NHS活化2～4h，然后逐滴加入到NH2?PEG?COOH的DMSO溶液中，攪拌反應2～4天，透析，然后真空冷凍干燥，即得COOH?PEG?FA；（3）將步驟（1）中制備的Fe3O4?PEI納米顆粒用DMSO洗滌后，重新分散于DMSO中，再將DMSO溶解的FI溶液加入到上述Fe3O4?PEI的DMSO溶液中，攪拌反應1～3天后，產物Fe3O4?PEI?FI分離洗滌，然后分散到DMSO中；（4）步驟（2）中制備的COOH?PEG?FA以及EDC和NHS溶解于DMSO后，攪拌活化2～4h；然后將活化的COOH?PEG?FA溶液加入到步驟（3）制備的Fe3O4?PEI?FI溶液中，攪拌反應2～4天，再分離洗滌，并分散于超純水中，得到Fe3O4?PEI?FI?PEG?FA納米顆粒水溶液；（5）向步驟（4）制備的Fe3O4?PEI?FI?PEG?FA納米顆粒水溶液中加入三乙胺，并攪拌20～40分鐘；然后向上述溶液中加入乙酸酐，繼續攪拌反應20～30小時；分離洗滌并分散于超純水中，即得。...
【技術特征摘要】
1.一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，包括: (1)將亞鐵鹽溶解于超純水中，加入NH3.H2O并于空氣氣氛下攪拌，然后將混合溶液轉移到高壓反應釜中，并將0.lg/mL的超支化聚乙烯亞胺PEI水溶液也加入到高壓反應釜中，攪拌混合均勻后，于130 140°C反應2 4小時；反應結束后，自然冷卻至室溫，將沉淀分離洗滌純化后，即得PEI包裹的四氧化三鐵納米顆粒Fe3O4-PEI ； (2)將FA溶解于DMSO中后，先用EDC和NHS活化2 4h，然后逐滴加入到NH2-PEG-C00H的DMSO溶液中，攪拌反應2 4天，透析，然后真空冷凍干燥，即得C00H-PEG-FA ； (3)將步驟(I)中制備的Fe3O4-PEI納米顆粒用DMSO洗滌后，重新分散于DMSO中，再將DMSO溶解的FI溶液加入到上述Fe3O4-PEI的DMSO溶液中，攪拌反應I 3天后，產物Fe3O4-PE1-FI分離洗滌，然后分散到DMSO中； (4)步驟(2)中制備的C00H-PEG-FA以及EDC和NHS溶解于DMSO后，攪拌活化2 4h;然后將活化的C00H-PEG-FA溶液加入到步驟(3)制備的Fe3O4-PE1-FI溶液中，攪拌反應2 4天，再分離洗滌，并分散于超純水中，得到Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒水溶液； (5)向步驟(4)制備的Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒水溶液中加入三乙胺，并攪拌20 40分鐘；然后向上述溶液中加入乙酸酐，繼續攪拌反應20 30小時；分離洗滌并分散于超純水中，即得。2.根據權利要求1所述的一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中的亞鐵鹽為FeCl2.4Η20，亞鐵鹽、超純水、NH3 -H2O的配比為I 1.5g: 7....
【專利技術屬性】
技術研發人員：沈明武，李靜超，蔡紅東，史向陽，張貴祥，鄭林豐，
申請(專利權)人：東華大學，上海市第一人民醫院，
類型：發明
國別省市：
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