一種定向誘導間充質干細胞分化的方法技術

本發明專利技術公開了一種定向誘導間充質干細胞分化的方法。本發明專利技術提供的定向誘導間充質干細胞分化的方法，包括如下步驟：將離體的誘導細胞接種并吸附于聚碳酸酯膜的下表面，將離體的間充質干細胞接種至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后將所述誘導細胞和所述間充質干細胞共培養，促使所述間充質干細胞分化為目標細胞；所述間充質干細胞和所述誘導細胞均不能通過所述聚碳酸酯膜的孔徑。UCMSCs向表皮細胞的分化在未來能夠為臨床皮膚再生的研究的進展起到有益作用。本發明專利技術為增加MSCs多向分化的誘導方法開拓思路，為進一步采用UCMSCs為種子細胞構建組織工程皮膚提供依據。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及。
技術介紹
在體內或體外特定的誘導條件下，間充質干細胞(MSCs)不僅可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、肌 肉細胞等中胚層間質組織細胞，還可跨越胚層界限，分化為外胚層的神經元、神經膠質細胞及內胚層的肝細胞等。所以近年來MSCs成為基礎醫學和臨床醫學組織器官損傷修復以及再生領域研究的熱點。而實現MSCs向表皮細胞的分化是利用其構建組織工程皮膚的關鍵步驟之一。MSCs分化的程序是可能存在于其生存的微環境中的指導信號，通過相應的信號轉導通路，啟動并強化關鍵基因表達，實現細胞分化。其實質就是MSCs的基因在時空上特異性表達，合成相應的蛋白質，從而細胞在生化、結構和功能方面發生改變，細胞表型隨之差異表現。指導轉錄因子及啟動基因表達的信號可能存在于MSCs生存的微環境中，研究表明，微環境中的各種因子表現類型、濃度和應用次序則是影響MSCs分化的重要因素。細胞局部的微環境包括細胞周圍多種細胞因子、激素、基質細胞、細胞外基質(extracellularmatrix, ECM)等，細胞因子的作用尤為重要，不同的細胞因子作用下MSCs可分化為不同的細胞類型。除了可溶性細胞信號分子外，直接的細胞-細胞相互作用對于干細胞的分化也是必要的。Rangappa等利用接觸培養和條件培養兩種方法培養人骨髓間充質干細胞和心肌細胞后，發現混合培養組用CMFDA標記的骨髓間充質干細胞表達肌球蛋白重鏈、β-actin和cTnT，而條件培養組只有β-actin表達。體內外實驗均顯示，MSCs與其他細胞(蒲肯野細胞、心肌細胞和肝細胞等)共培養時有自發的細胞融合，且MSCs在沒有誘導劑的情況下分化成其他細胞，提示細胞融合可能是促使MSCs分化的原因之一。MSCs的分化與其生長的微環境有密切關系，因此，體外誘導MSCs分化是通過采取不同的方法模擬體內相應組織細胞生長的真實環境和必要條件。利用目標細胞參與進行共培養誘導的方法往往比較簡便易行。直接接觸式共培養利用MSCs與其他細胞共培養時有自發的細胞融合，或細胞的自分泌與旁分泌必要的細胞因子，MSCs在沒有誘導劑的情況下分化成其他細胞。但這種誘導方法存在兩種細胞的分離比較困難的最大缺點，為后續的鑒定或應用帶來障礙。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供。本專利技術提供了，包括如下步驟:將離體的誘導細胞接種并吸附于聚碳酸酯膜的下表面，將離體的間充質干細胞接種至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后將所述誘導細胞和所述間充質干細胞共培養，促使所述間充質干細胞分化為目標細胞；所述間充質干細胞和所述誘導細胞均不能通過所述聚碳酸酯膜的孔徑。所述目標細胞為非胚胎干細胞。所述誘導細胞可為表皮干細胞，具體可為人表皮干細胞。所述目標細胞可為表皮干細胞，具體可為人表皮干細胞。所述間充質干細胞可為臍帶間充質干細胞，具體可為人臍帶間充質干細胞。所述聚碳酸酯膜的孔徑可為0.2 μ m-2.0 μ m，優選為0.4_1.0 μ m，更加優選為0.4 μ m $ 1.0 μ m。所述共培養具體可在細胞培養板的培養孔和放置于所述培養孔上的Transwell小室中進行。所述共培養時，所述誘導細胞的培養在細胞培養板的培養孔進行。所述間充質干細胞的培養在Transwell小室中進行。所述聚碳酸酯膜可以阻斷細胞通過，所述誘導細胞分泌的誘導因子通過所述聚碳酸酯膜后誘導間充質干細胞定向分化為具有所述誘導細胞屬性的目標細胞。所述表皮干細胞表現為表達P63、CK19和β 1-1ntegrin的細胞。P63、CK19和β 1-1ntegrin是三種早期表 皮細胞的標志物，P63經常用來鑒定表皮干細胞，而CK19和β Ι-1ntegrin是表皮干細胞相對特異的標志物。缺乏β l-1ntegrin會顯著影響體外角質細胞的分化，而持續表達的β l-1ntegrin對于維持表皮干細胞的特性是重要的。近年來利用Transwell技術通過共培養對間充質干細胞進行非直接接觸式共培養誘導分化越來越多的得到應用，通常是將間充質干細胞與誘導細胞分別接種于Transwell上下室之中，通過誘導細胞生長為間充質干細胞創造適宜分化的微環境，通過旁分泌等方式誘導間充質干細胞發生分化以及表型的轉變。而間充質干細胞與誘導細胞不直接接觸是Transwell技術的特點之一,能夠使得誘導后的細胞成分相對單一，避免了分選、純化或標記等繁瑣步驟，為方便誘導后細胞的鑒定及應用奠定基礎。本專利技術中先通過對UCMSCs在不同孔徑常用Transwell插件聚碳酸酯膜生長以及遷移情況進行觀察，確定0.4 μ m的孔徑和1.0 μ m的孔徑可以阻斷細胞遷移，為進一步采用合適孔徑的聚碳酸酯膜正反兩面培養細胞提供前期實驗準備。根據上述實驗結果，本專利技術建立了預培養目標細胞的新型間接接觸式共培養方法，將臍帶間充質干細胞與表皮干細胞于聚碳酸酯膜正反兩面進行共培養，提供了雙層ESCs生長的環境，尤其是膜底面的hESCs能夠近距離的提供穩定的局部微環境，并不排除UCMSCs與ESCs通過聚碳酸酯膜微孔有直接接觸，掃描電鏡發現細胞偽足能夠探入微孔，大大提高了誘導效率，而同時，聚碳酸酯膜物理性地隔開了兩種細胞。使用這種系統誘導UCMSCs分化并不需要將干細胞與目標細胞進行混合，也不需要特定的誘導液。而這種隔離能夠簡化鑒定誘導后細胞的步驟。UCMSCs能夠在本專利技術提供的新型的非直接接觸式共培養系統內誘導分化為表皮樣細胞。本專利技術為新型非直接接觸式共培養在UCMSCs分化為表皮樣細胞中的應用提供了實驗依據。同樣，該共培養系統也可應用于其它類型細胞的分化研究，在基礎課題以及臨床研究中具有潛在的重要價值。而UCMSCs向表皮細胞的分化在未來能夠為臨床皮膚再生的研究的進展起到有益作用。本專利技術為增加MSCs多向分化的誘導方法開拓思路，為進一步采用UCMSCs為種子細胞構建組織工程皮膚提供依據。附圖說明圖1為實施例1中掃描電鏡下UCMSCs在不同孔徑聚碳酸酯膜的生長、遷移情況(X1500)。圖2為實施例2中的分組處理的流程示意圖。圖3為實施例2中掃描電鏡觀察的照片。圖4為實施例2中相差顯微鏡觀察的照片。圖5為實施例2中免疫熒光檢測的結果。圖6為實施例2中Western Blotting圖譜。圖7為實施例2中實時定量PCR檢測結果。圖8為實施例2中流式細胞術檢測結果。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本專利技術，但并不限定本專利技術。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例中，應用SPSS 13.0統計分析軟件進行統計學分析，數據以X ± S表示，采用單因素方差分析比較，以P < 0.01為統計學差異有顯著意義。β I整合素(β 1-1ntegrin)、角蛋白19 (CK19)和P63均為表皮干細胞的主要標志物。人表皮干細胞(Epidermal Stem Cells, ESCs):楊亞東，伍津津，朱堂友，畢建軍，表皮干細胞的分選鑒定及培養，重慶醫學2008年2月第37卷第3期，275-281 ;馬英智，王心蕊，何旭，牛云，李玉林，人表皮干細胞的分離、純化培養及鑒定，中國實驗診斷學2009本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種定向誘導干細胞分化的方法，包括如下步驟：將離體的誘導細胞接種并吸附于聚碳酸酯膜的下表面，將離體的間充質干細胞接種至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后將所述誘導細胞和所述間充質干細胞共培養，促使所述間充質干細胞分化為目標細胞；所述間充質干細胞和所述誘導細胞均不能通過所述聚碳酸酯膜的孔徑。

【技術特征摘要】
1.一種定向誘導干細胞分化的方法，包括如下步驟:將離體的誘導細胞接種并吸附于聚碳酸酯膜的下表面，將離體的間充質干細胞接種至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后將所述誘導細胞和所述間充質干細胞共培養，促使所述間充質干細胞分化為目標細胞；所述間充質干細胞和所述誘導細胞均不能通過所述聚碳酸酯膜的孔徑。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述誘導細胞為表皮干細胞。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于:所述誘導細胞為人表皮干細胞。4.如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述目標細胞為表皮干細胞。5.如權利要求4所述的方法，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：柴家科，李東杰，申傳安，孫天駿，
申請(專利權)人：中國人民解放軍總醫院第一附屬醫院，
類型：發明
國別省市：