多能干細胞的傳代方法及其用途技術

本發明專利技術涉及生物技術領域，具體涉及多能干細胞的傳代方法及其用途。該方法包括：將定量的多能干細胞小球移入培養基中，并混合均勻；利用移液器吸取混于培養基的所述多能干細胞小球，并利用所述移液器產生的壓力擠壓，使其通過30-70μm細胞篩的篩網，形成混于培養基的更多的多能干細胞小團塊；將所述混于培養基的多能干細胞小團塊移入新的培養皿中，完成傳代。該方法用于脊椎動物門的胚胎干細胞和誘導多能性干細胞的傳代。本發明專利技術適于懸浮培養形成的多能干細胞小球，是一種無需酶消化的新型傳代方法。利用該方法傳代后多能干細胞克隆球存活率高，可以達到90％，每次傳代比率可達1:8至1:10，可以滿足干細胞大規模量產化的需求。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，具體涉及多能干細胞的傳代方法及其用途。
技術介紹
多能干細胞(Pluripotent Stem Cells,PSCs)可以在體外適宜的條件下快速增殖而不分化，并且在經過體外大量擴增后，再給予特定條件處理，例如使用蛋白質或小分子化合物的組合誘導，可以使其定向的分化成具有特定功能的細胞，將這些分化后失去多能性的特定細胞收集起來就可用于治療人類的相關疾病，例如可以將多能干細胞誘導成神經細胞后，注入大腦內用于治療因神經元缺損導致的老年性癡呆或亨廷頓氏癥。工業化生產中，多能干細胞的常見增殖培養方式是貼壁培養和懸浮培養。其中，相比貼壁培養，懸浮培養方式有很多優點，適用于工業化大規模的生產模式，是未來干細胞生物研究和應用發展的趨勢所亟需的技術:懸浮培養的多能干細胞的分布呈球形，易于操作處理和回收細胞；懸浮培養可以充分利用空間及培養基，便于集中控制并降低成本，提高效率；懸浮系統產出的多能干細胞更利于向特定功能細胞如神經前體細胞和中胚層心肌前體細胞分化。細胞培養過程中，當多能干細胞增殖達到一定密度后，需要進行傳代，進行再培養。現有的傳代方法主要有機械傳代、酶消化傳代，以及酶消化加機械傳代三種方式。現有的機械傳代是利用極細的玻璃絲將大的集落劃切成數枚小片傳代，可用于貼壁培養，而懸浮培養的多能干細胞呈實體球狀，其毫無附著，無法固定，很難用玻璃絲將其劃開，因而不適宜用現有機械 傳代。酶消化傳代是向細胞中加入胰酶等酶進行消化處理，使細胞分散后傳代；可用于貼壁培養，而酶消化對懸浮培養的細胞球表面的細胞起作用快，而球內部細胞消化慢，造成消化不均一，影響了傳代細胞的性能，例如團塊大于150微米的多能干細胞小塊在接種到小鼠飼養層細胞上后易于自發分化，而小于40微米的多能干細胞小塊則易于死亡。因而懸浮培養不適宜用酶消化傳代。酶消化配合移液槍吹打相較單獨酶消化，雖然消化相對均勻，但傳代時仍不易掌握和控制，導致制備的小團塊大小不均一，無法抑制自發分化，并且降低定向分化的可行性。并且長期采用酶消化，容易引起多能干細胞發生染色體變異或缺失。可見，現有的細胞傳代方法不適于懸浮培養多能干細胞的傳代。
技術實現思路
本專利技術提供了一種多能干細胞的傳代方法及其用途，實現了懸浮培養體系中多能干細胞的傳代。本專利技術的技術方案是這樣實現的:多能干細胞的傳代方法，包括下列步驟:步驟A:將多個多能干細胞小球移入培養基中，并混合均勻；步驟B:利用移液器吸取混于培養基的所述多能干細胞小球，并利用所述移液器產生的壓力擠壓混于培養基的所述多能干細胞小球，使其通過30-70 μ m細胞篩的篩網，形成混于培養基的多能干細胞小團塊；步驟C:將所述混于培養基的多能干細胞小團塊移入新的培養皿中，繼續培養，完成傳代；所述多能干細胞小球為懸浮培養形成的多能干細胞的球狀聚集體，并且所述多能干細胞小球的直徑為240±40μπι。進一步地,所述步驟B包括:利用移液器將混合后的混于培養基的所述多能干細胞小球，分批通過30-70 μ m細胞篩的篩網；并且每批吸取800μ I混于培養基的所述多能干細胞小球，每批在所述篩網的不同位置通過。進一步地,所述步驟A包括:將每70-90個所述多能干細胞小球移入3ml所述培養基中，并混合均勻。進一步地，所述移液器為移液槍，所述移液槍所用的槍頭為帶濾芯槍頭。進一步地,所述步驟A之前進一步包括:向所述培養基中加入10 μ mo I/L Rock抑制劑Y-27632，并將所述培養基在37°C水浴中預熱。進一步地，所述步驟A中的混合均勻包括:利用移液管或移液槍反復吸吹。進一步地，所述繼續培養包括:將所述培養皿置于37°C，含5%C02的培養箱中。進一步地，所述步驟B之后和所述步驟C之前進一步包括:用磷酸鹽緩沖液或培養基潤濕所述培養皿的底部的內表面。進一步地，所述細胞篩為尼龍篩網的無菌細胞篩，和/或，所述培養基為無血清成分確定培養基；和/或，所述培養皿為皮氏培養皿。所述的多能干細胞的 傳代方法的用途，所述多能干細胞的傳代方法用于脊椎動物門的胚胎干細胞和誘導多能性干細胞的傳代。與現有技術相比，本專利技術提供的多能干細胞的傳代方法是:用移液器吸取懸浮培養的多能干細胞小球，并利用該移液器產生的壓力使細胞小球通過細胞篩的篩網，同時利用篩網具有均勻小孔的特點，從而將其切割成均勻的圓柱形小團塊，進行傳代，其中，無需細胞自身具有附著點，并且為無酶消化的傳代，因而避免了細胞染色體變異；可見，該方法適于懸浮培養形成的多能干細胞小球，利用該方法傳代后多能干細胞存活率高，可以達到90%，每次傳代比率可達1:8至1:10。此外，本專利技術提供的技術方案還可以達到下列技術效果:(I)簡單易行:本專利技術通過細胞篩和移液器兩個工具，即可完成傳代，所用工具操作簡單易行。(2)成本低，耗時少:本專利技術的傳代方法無需酶消化，因而避免了酶消化中涉及的清洗、處理、終止等繁瑣步驟，因而不僅節省了酶試劑所需的成本，而且節省了生產時間，可用于工業化量產多能干細胞。(3)提高細胞活性，防污染:本專利技術分批切割多能干細胞小球，可以保證得到的細胞小團塊尺寸更均勻，從而提高細胞活性；并且每批都在細胞篩的不同位置切割，可以防止污染。(4)培養基安排合理:每70-90個多能干細胞小球用3ml培養基，體積適量，既可以保證細胞生長所需的營養，又可以避免培養基的浪費。(5)切割所用的氣流均勻和緩:使用帶濾芯的槍頭，可以產生均勻和緩的氣壓，從而進一步提高切割的均勻性。(6)增加細胞的存活率:培養基中加入Rock抑制劑Y-27632，可顯著促進細胞增殖，提聞細胞的克隆球形成能力。(7)保證培養基順利鋪展:用磷酸鹽緩沖液或培養基潤濕所述培養皿的底面，增加了培養皿的浸潤性，從而保證培養基可以順利鋪展，防止多能干細胞克隆球相互聚集成團，抑制了自發分化，提高干細胞品質。附圖說明為了更清楚地說明本專利技術的具體實施方式，下面將對具體實施方式中所需要使用的附圖作簡單介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本專利技術的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本專利技術的實施例一提供的多能干細胞的傳代方法流程圖；圖2為本專利技術的實施例二提供的懸浮培養的多能干細胞小球的形態圖；圖3為本專利技術的實施例二提供的多能干細胞傳代當天和傳代第二日的形態圖；圖4為本專利技術的實施例二提供的人類胚胎干細胞的8次傳代后的多能性染色鑒定結果具體實施例方式為使本專利技術的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本專利技術的技術方案進行清楚、完整的描述，基于本專利技術中的具體實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所得到的所有其它實施例，都屬于本專利技術所保護的范圍。實施例一多能干細胞的傳代方法，如圖1所示，包括下列步驟:步驟101:將多個多能干細胞小球移入培養基中，并混合均勻；步驟102:利用移液器吸取混于培養基的所述多能干細胞小球，并利用移液器產生的壓力擠壓混于培養基的所述多能干細胞小球，使其通過30-70 μ m細胞篩的篩網，形成混于培養基的多能干細胞小團塊；步驟103:將所述混于培養基的多能干細胞小團塊移入新的培養皿中，繼續培養，完成傳代；所述多能干細胞小球為懸浮培養(非貼壁式)形成的多能干細胞球狀聚集體，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
多能干細胞的傳代方法，其特征在于，包括下列步驟：步驟A：將多個多能干細胞小球移入培養基中，并混合均勻；步驟B：利用移液器吸取混于培養基的所述多能干細胞小球，并利用所述移液器產生的壓力擠壓混于培養基的所述多能干細胞小球，使其通過30?70μm細胞篩的篩網，形成混于培養基的多能干細胞小團塊；步驟C：將所述混于培養基的多能干細胞小團塊移入新的培養皿中，繼續培養，完成傳代；所述多能干細胞小球為懸浮培養形成的多能干細胞的球狀聚集體，并且所述多能干細胞小球的直徑為240±40μm。

【技術特征摘要】
1.多能干細胞的傳代方法，其特征在于，包括下列步驟: 步驟A:將多個多能干細胞小球移入培養基中，并混合均勻； 步驟B:利用移液器吸取混于培養基的所述多能干細胞小球，并利用所述移液器產生的壓力擠壓混于培養基的所述多能干細胞小球，使其通過30-70 μ m細胞篩的篩網，形成混于培養基的多能干細胞小團塊； 步驟C:將所述混于培養基的多能干細胞小團塊移入新的培養皿中，繼續培養，完成傳代； 所述多能干細胞小球為懸浮培養形成的多能干細胞的球狀聚集體，并且所述多能干細胞小球的直徑為240 ±40 μ m。2.如權利要求1所述的多能干細胞的傳代方法，其特征在于，所述步驟B包括: 利用移液器將混合后的混于培養基的所述多能干細胞小球，分批通過30-70 μ m細胞篩的篩網； 并且每批吸取800μ I混于培養基的所述多能干細胞小球，每批在所述篩網的不同位置通過。3.如權利要求2所述的多能干細胞的傳代方法，其特征在于，所述步驟A包括: 將每70-90個所述多能干細胞小球移入3ml所述培養基中，并混合均勻。4.如權利要求1所述的多能干細胞的傳代方法，其特征在于，所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：蔣斌，李天晴，季維智，牛昱宇，
申請(專利權)人：云南中科靈長類生物醫學重點實驗室，
類型：發明
國別省市：