花藥特異性表達載體及其構建方法技術

本發明專利技術涉及一種花藥特異性表達載體及其構建方法。該表達載體為SEQIDNO1所示的堿基序列。本載體可以在擬南芥花藥中特異表達，且表達部位為花藥絨氈層。利用該載體表達特點可以為花藥絨氈層發育、基因表達模式、基因花藥特異性表達及沉默等生物學研究提供便利。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種。
技術介紹
1.基因克隆技術:一般來說，基因克隆技術包括把來自不同生物的基因和有自主復制能力的載體DNA在體外進行人工連接，構建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達，因此基因克隆技術又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組DNA技術以及基因工程等。采用重組DNA技術，將不同來源的DNA分子在體外進行特異切割，重新連接，組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代分子。 2.植物基因工程技術:用人工的方法，從不同生物中提取外源基因片段及載體DNA，經過體外切割、拼接和重組，然后采取某種方法，把重組后的帶有外源基因的載體DNA引入植物細胞，并使其在植物細胞內進行復制和表達，以達到預期的改變受體植物細胞遺傳特性的目的.此種過程即稱為植物基因工程.已知土壤中的根癌農桿菌(AgrobacteriumTumefaciens)的Ti質粒和發根農桿菌(A.rhizogenes)的Ri質粒是轉移外源基因片段的理想載體DNA.目的基因的Ti質粒或Ri質粒的重組體通過細菌或微粒槍射法，能轉移到多數雙子葉植物體內 ，并便受體植物表現出目的基因所控制的遺傳特性.利用上述方法，目前已培養出一批具有抗蟲、抗病毒或抗除草劑特性的作物“工程株”;但重組體進入單子葉植物還有困難，目前農桿菌已在轉化水稻、玉米、小麥、石刁柏等單子葉植物上取得一定的成功。3.顯微鏡觀察:一、光學顯微鏡一般由載物臺、聚光照明系統、物鏡，目鏡和調焦機構組成。光學顯微鏡是利用光學原理，把人眼所不能分辨的微小物體放大成像，以供人們提取微細結構信息的光學儀器。二、熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射后可發熒光；另有一些物質本身雖不能發熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經紫外線照射亦可發熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質進行定性和定量研究的工具之一。三、共聚焦顯微鏡可以通過精細激光束觀察樣本，并且通過合理控制激光束可以得到非常薄的光學切片，用以觀察活體內部的形態、結構、基因表達等。目前常用的35s過表達啟動子在花藥中的表達效果不佳，常常出現不表達的情況，且35s啟動子在植物各個組織器官均會啟動基因表達，難以實現在花藥中特異性表達某些基因，
技術實現思路
本專利技術的目的之一在于克服現有技術中存在的問題，提供一種花藥特異性表達載體，為花藥特異性表達的某些基因提供方便。本專利技術的目的之二在于提供該表達載體的構建方法。本專利技術構思是:構建含有花藥特異性表達基因acos5啟動子的表達載體，并以GFP作為報告基因，將構建好的載體轉入農桿菌，并轉化擬南芥，觀察報告基因的表達定位，以確定該載體的適用性。根據上述專利技術構思，本專利技術采用下述技術方案: 一種花藥特異性表達載體，其特征在于該表達載體為SEQ ID NO I所示的堿基序列。一種構建上述的花藥特異性表達載體的方法，其特征在于該構建方法的具體步驟為: a.根據AC0S5啟動子序列設計引物，上下游引物兩端分別加入HidIII和Sacl酶切位點，長度選取轉錄起始點至上游2978bp ;所述的引物序列為:上游(HindIII) CCCAAAGCTTGTAGAGGCTGAGAAATTGTA下游(SacI) CGGAGCTCGATTTATGTGTTAGGAACAGGG 采用PCR方法對AC0S5啟動子序列進行擴增，并將所擴增的目的片段用taq酶進行加A處理，加A后進行膠回收操作，將所回收得到的目的片段連入PMD18-T載體進行測序； b.將P1300載體用Hindlll、SacI進行酶切并回收載體片段，然后將步驟a所得測序正確的AC0S5啟動子用Hindlll、SacI從T載體上酶切下并回收，連入P1300載體中；然后進行陽性克隆篩選和鑒定；將鑒定后的連有AC0S5啟動子的P1300載體以BamH1、Sal I進行酶切，并回收載體片段備用。將測序正確的GFP片段用BamH1、Sal I從T載體上酶切下來，并和連有AC0S5啟動子的P1300載體相連接，然后進行陽性克隆篩選和鑒定。上述步驟a中擴增AC0S5啟動子序列的擴增參數為:權利要求1.一種花藥特異性表達載體，其特征在于該表達載體為SEQ ID NO I所示的堿基序列。2.—種構建根據權利要求1所述的花藥特異性表達載體的方法，其特征在于該構建方法的具體步驟為: a.根據AC0S5啟動子序列設計引物，上下游引物兩端分別加入HidIII和Sacl酶切位點，長度選取轉錄起始點至上游2978bp ;所述的引物序列為:上游(HindIII) CCCAAAGCTTGTAGAGGCTGAGAAATTGTA下游(SacI) CGGAGCTCGATTTATGTGTTAGGAACAGGG 采用PCR方法對AC0S5啟動子序列進行擴增，并將所擴增的目的片段用taq酶進行加A處理，加A后進行膠回收操作，將所回收得到的目的片段連入PMD18-T載體進行測序； b.將P1300載體用Hindlll、SacI進行酶切并回收載體片段，然后將步驟a所得測序正確的AC0S5啟動子用HindII1、SacI從T載體上酶切下并回收，連入P1300載體中；然后進行陽性克隆篩選和鑒定；將鑒定后的載體以BamH1、Sal I進行酶切，并回收載體片段備用。將測序正確的GFP片段用BamH1、Sal I從T載體上酶切下來，并和連有AC0S5啟動子的P1300載體相連接，然后進行陽性克隆篩選和鑒定。3.據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟a中擴增AC0S5啟動子序列的擴增參數為:4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟b所述的將ACOS5連入P1300載體所選用的連接體系的組成及體積，按每10μ I連接體系計，為: AC0S5 片段:1.5μ1 ρ1300 載體:0.5μ1 Solution I:5 μ I ddH20:3 μ I ο全文摘要本專利技術涉及一種。該表達載體為SEQIDNO1所示的堿基序列。本載體可以在擬南芥花藥中特異表達，且表達部位為花藥絨氈層。利用該載體表達特點可以為花藥絨氈層發育、基因表達模式、基因花藥特異性表達及沉默等生物學研究提供便利。文檔編號C12N15/84GK103146747SQ201310056748公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月22日 優先權日2013年2月22日專利技術者孫虎林, 褚艷霞, 鄭幫, 鄭亞杰, 張衛 申請人:上海大學本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種花藥特異性表達載體，其特征在于該表達載體為SEQ?ID?NO?1?所示的堿基序列。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：孫虎林，褚艷霞，鄭幫，鄭亞杰，張衛，
申請(專利權)人：上海大學，
類型：發明
國別省市：