本發明專利技術公開了一種生物技術領域的降低稻米表觀直鏈淀粉含量和改善淀粉粘性、從而改良稻米食味品質的方法，此方法通過干擾水稻中可溶性淀粉合成酶SSSIIb基因表達得以實現。構建了SSSIIb基因RNA干擾載體，利用農桿菌介導的方法，獲得了干擾SSSIIb基因的轉基因水稻。通過PCR實驗表明，目的基因已經整合到水稻基因組中。選育得到純合系轉基因水稻，該類轉基因水稻胚乳中直鏈淀粉含量較未轉化親本日本晴有明顯的降低。通過快速粘度測試儀分析表明，轉基因稻米淀粉粘度降低，且糊化溫度降低，稻米的食味特征明顯改善。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術是一種植物生物
的降低水稻種子中表觀直鏈淀粉含量的方法，具體涉及一種用RNA干擾技術降低水稻種子中直鏈淀粉含量從而改良稻米品質的方法。
技術介紹
植物轉基因技術通過各種方法將動植物或微生物中分離得到的目的基因轉移到植物的基因組中，使之穩定表達。該技術應用于農業，在農作物抗蟲、抗逆、抗病及品質改良方面發揮巨大作用。淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，是水稻胚乳中最主要的貯存物質，兩類淀粉的組成比例是決定稻米適口性的最重要因素之一。通常來說，食味值好的稻米的直鏈淀粉含量(AC)為10-20%。一般而言，AC越高的品種其RVA (快速粘度分析)譜崩解值越小，消減值和回復值越大(賈良等，作物學報，2008，34 (5):790-794)。而崩解值在一定程度上與柔軟性、粘散性、滋味、馨香味、光澤、冷飯質地等食味指標呈現正相關性(李欣等，中國農業科學，2005, 38 (4): 657-663)。在當今市場上，軟米因其口感粘香且硬度適中，價格遠高于東北大米等常規稻米。這類稻米中的直鏈淀粉含量往往較低，介于8-12%之間。水稻胚乳中參與淀粉合成的酶至少有四大類，分別是ADP葡萄糖磷酸合成酶(AGPP)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)及淀粉去分支酶(DBE)。淀粉合成酶主要由顆粒性淀粉合成酶(GBSS)及可溶性淀粉合成酶(SSS)組成， 其功能分別是合成直鏈淀粉及支鏈淀粉。可溶性淀粉合成酶按其功能又被分為八種同工型，即SSS1、SSSIIa, SSSIIb,SSSIIc,SSSIIIa,SSSIIIb,SSSIIIc,SSSIVa和SSSIVb等，其中的幾個基因已有較深入的功能研究。例如，水稻SSSI基因在胚乳早期到末期都發揮作用。Fujita等通過對水稻SSSI基因突變體的研究發現，該基因突變后稻米糊化溫度增加，而淀粉顆粒形狀大小及結晶度無變化(Fujita 等，Plant Physiology, 2006,140 (3):1070 - 1084)。SSSIIa 突變體的淀粉易糊化、也易溶于尿素，推測SSSIIa在淀粉合成中的作用是延長支鏈淀粉上的A和BI鏈(Nakamura 等 2002，104(1):1-8 ；Qian 等，2011，53(9):756 - 765)。在 SSIIIa 基因缺失后，直鏈淀粉含量稍有提高，支鏈淀粉中的長支鏈增加，淀粉顆粒形態發生變化，直徑變小且形狀變圓，結晶度降低(Fujita, Plant Physiology, 2007，144 (4):2009_2023)。而 SSSIIb 作為水稻可溶性淀粉合成酶亞家族的一員，其功能尚未見報道。在本專利技術中，利用轉基因手段，采用RNA干擾技術，抑制了水稻中SSSIIb基因的表達。通過多代自交和選育，獲得了純合的轉基因新品系。對轉基因水稻新品系成熟稻米進行品質檢測，顯示該稻米直鏈淀粉含量有明顯的降低；利用淀粉粘度速測儀(RVA儀)對米粉檢測，發現其粘度下降，預示該類稻米會具有較優良的食味品質。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種培育轉基因水稻的方法，該方法獲得的稻米具有較優良的食味品質。本專利技術構建了水稻SSSIIb基因的RNA干擾載體，將其導入水稻品種日本晴中，并通過PCR擴增等技術手段進行檢測，結果表明RNA干擾載體已經導入至水稻材料中并得到表達。本專利技術一種培育優良食味品質稻米的方法，是通過干擾水稻中可溶性淀粉合成酶SSSIIb基因表達得以實現。具體是構建SSSIIb基因RNA干擾載體，利用農桿菌介導的方法將干擾載體導入水稻，獲得干擾SSSIIb基因的轉基因水稻。本專利技術所述的方法，包括如下步驟:(I)以序列如SEQ ID N0.2和3的引物對，擴增得到序列如SEQ ID N0.1所示和擴增產物；(2)構建RNA干擾載體:利用植物組成型表達啟動子，構建含SEQ ID N0.1序列正反向片段的植物表達載體；(3)將步驟(2)的RNA干擾載體導入水稻品種中，獲得轉基因水稻。上述序列SEQ ID N0.1是水稻可溶性淀粉合成酶IIb基因(SSSIIb)編碼區中的一段序列，與SSSIIb基因第2至5外顯子間583bp序列同源。本專利技術還公開了一種轉基因水稻，它是通過下述方法獲得:(I)以序列如SEQ ID N0.2和3的引物對，擴增得到序列如SEQ ID N0.1的片段；(2)構建RNA干擾載體:利用植物組成型表達啟動子，構建含SEQ ID N0.1序列正反向片段的植物表達載體；(3)將步驟(2)的RNA干擾載體導入水稻品種中，獲得轉基因水稻。 上述步驟(2)具體是:擴增產物經T/A克隆連接入pMD18-T載體，用BamH I和Xba I雙酶切回收目的片段I ;將目的片段I通過Bgl II和Xba I雙酶切位點插入載體PlOll得到PlOll-1 ;再將目的片段I通過BamH I和Spe I雙酶切位點插入載體pl011-1，獲得RNA干擾載體。本專利技術中所述的RNA干擾載體通過根瘤農桿菌介導等轉基因方法，將RNA干擾載體導入水稻品種中，獲得轉基因水稻；相對于未轉化水稻品種，該種轉基因水稻稻米具有適當降低的表觀直鏈淀粉含量，食味品質明顯改良。本專利技術提供了一種降低水稻直鏈淀粉的方法，對已干擾SSSIIb基因表達的轉基因水稻稻米進行各項品質指標的檢測，顯示其品質特性發生了一系列變化。該品系與親本日本晴相比，稻米淀粉粘度值及直鏈淀粉含量均下降，食味有所改善。附圖說明圖1是含SSSIIb基因RNA干擾結構的農桿菌雙元載體T-DNA區的結構。其中，P35S和T35S分別表示35S基因的啟動子和終止子區；N0S表示農桿菌胭脂堿合成酶基因終止子；Hyg表示潮霉素抗性基因；CTS，β葡萄糖苷酸酶基因；LB和RB示T-DNA區的左右邊界序列。Anti和Sense分別表示用于構建RNA干擾載體的SSSIIb基因片斷的反向和正向結構。圖2是利用PCR技術鑒定轉基因水稻。其中1-8為含有RNA干擾結構的8個轉基因系，9為未轉化親本日本晴。圖3是含有RNA干擾結構的純合轉基因水稻及其未轉化對照稻米的直鏈淀粉含量。SSSIIb1-1 — SSSIIb1-4 為 4 個轉基因系。圖4是含有RNA干擾結構的純合轉基因水稻及其未轉化對照米粉的粘滯性譜特征圖。SSSIIb1-1 — SSSIIb1-4 為 4 個轉基因系。具體實施例方式通過以下三個實例進一步對本專利技術進行了說明與定義而并非限制。通過實例，科研人員可以對本專利技術有更清楚的了解，可以在此基礎上對本專利技術做出一定的變更和修改，以獲得不同的研究效果。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明均為常規方法。實驗過程中涉及到的試劑均為常規試劑，使用均參照產品使用說明書使用。實施例1DNA序列的獲得及RNA干擾載體的構建根據水稻全基因組信息，獲得SSSIIb的編碼序列后，在Grammne網站上比較該基因與其他同工型的同源性。設計特異性引物SSSIIbi(上游引物5’-AGGCTGATCATGTTGAG-3’，SEQ ID N0.2 ;下游引物 5’-G TGTTGATTTTGTGTTT-3’，SEQ ID N0.3)用于 RNA 干擾片斷的擴增。擴增出的序列如SEQ ID N0.1。取日本晴的幼嫩水稻葉片用冷酚法提取水稻總本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種優良食味品質轉基因水稻的培育方法，其特征在于：構建SSSIIb基因RNA干擾載體，利用農桿菌介導的方法將干擾載體導入水稻，獲得干擾SSSIIb?基因的轉基因水稻。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉巧泉，李娟，張昌泉，蔣美艷，于恒秀，顧銘洪，
申請(專利權)人：揚州大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。