本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種新型的胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志物GM-CSFRα（粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體α鏈）及其應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)以胚胎干細(xì)胞直接作為免疫原，制備的GM-CSFRα多克隆抗體或兔單克隆抗體GM-CSFRα，作為干細(xì)胞鑒定試劑，檢測的特異性和靈敏度更高，且可用于胚胎干細(xì)胞的分離和活性檢測。包含GM-CSFRα多克隆抗體或兔單克隆抗體GM-CSFRα的胚胎干細(xì)胞檢測試劑盒除了用于鑒定胚胎干細(xì)胞全能性以外，還可同時(shí)用于檢測干細(xì)胞活性，拓展了檢測試劑盒的功能。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于細(xì)胞生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志物GM-CSFR a及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ES cells)是指從胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離獲得的，能在體外長期培養(yǎng)并保持自我更新能力和分化為所有三個(gè)胚層細(xì)胞潛能的正常二倍體細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞的高度自我更新能力和分化全能性是它區(qū)別于其它細(xì)胞的重要特征，它的特異性分子標(biāo)志，對于胚胎干細(xì)胞的鑒定、分離以及自我更新和分化機(jī)制的研究，有著十分重要的意義。目前常用的胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志包括轉(zhuǎn)錄因子0CT4、NAN0G、REX1等；表面標(biāo)志物SSEA-l、SSEA-3、TRA-l-60、⑶9等；這些胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物相應(yīng)抗體，已被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞檢測試劑盒，用于干細(xì)胞的鑒定與分離。目前大量研究結(jié)果表明，大部分已應(yīng)用于檢測試劑盒的胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志物抗體并不是直接從胚胎干細(xì)胞獲得的，例如SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60等抗體是由畸胎瘤細(xì)胞免疫獲得的；SSEA-3抗體是從小鼠胚胎免疫獲得；0CT4、NAN0G這些轉(zhuǎn)錄因子的抗體則直接使用蛋白作為免疫原免疫動物所獲得的。而且這些標(biāo)志物的特異性有一定的局限性:它們在一些成體干細(xì)胞、正常組織或癌細(xì)胞中也有一定表達(dá)，胚胎干細(xì)胞特異性的膜表面標(biāo)志數(shù)量更是有限。因此，開發(fā)更靈敏、特異性更高的胚胎干細(xì)胞鑒定試劑意義重大。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種新型的胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志物GM-CSFR a及其應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)的一種胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志物GM-CSFRa (粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體a鏈)，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本專利技術(shù)直接以胚胎干細(xì)胞作為免疫原，免疫兔子，分離兔子脾臟細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出產(chǎn)GM-CSFRa兔單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，應(yīng)用于干細(xì)胞的鑒定與分離。本專利技術(shù)提供的GM-CSFRa可作為胚胎干細(xì)胞功能性鑒定標(biāo)志物。GM-CSFRa兔單克隆抗體識別天然構(gòu)象表位，除鑒定胚胎干細(xì)胞全能性以外，可同時(shí)用于檢測干細(xì)胞活性。本專利技術(shù)還提供胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志物GM-CSFRa在鑒定胚胎干細(xì)胞中的應(yīng)用，用GM-CSFRa單克隆抗體或GM-CSFRa多克隆抗體通過檢測抗原抗體相互作用來鑒定胚胎干細(xì)胞。所述GM-CSFR a單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株ZJUESRMAB29(保藏號CGMCC N0.7302)產(chǎn)生。檢測抗原抗體相互作用的方法，例如免疫細(xì)胞化學(xué)法ICC、IHC染色或免疫共沉淀等。還可以通過檢測細(xì)胞中GM-CSFRa基因的表達(dá)量來鑒定胚胎干細(xì)胞。本專利技術(shù)進(jìn)一步提供一種胚胎干細(xì)胞檢測試劑盒，所述試劑盒包含GM-CSFRa單克隆抗體和/或GM-CSFRa多克隆抗體。所述GM-CSFRa單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株ZJUESRMAB29 (保藏號 CGMCCN0.7302)產(chǎn)生。本專利技術(shù)還提供產(chǎn)GM-CSFRa單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株ZJUESRMAB29，現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，保藏編號CGMCC N0.7302，保藏日期2013年2月5日。本專利技術(shù)還提供由所述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的GM-CSFRa單克隆抗體在鑒定胚胎干細(xì)胞中的應(yīng)用。本專利技術(shù)以胚胎干細(xì)胞直接作為免疫原，制備的兔單克隆抗體GM-CSFRa或GM-CSFRa多克隆抗體，作為干細(xì)胞鑒定試劑，檢測的特異性和靈敏度更高，且可用于胚胎干細(xì)胞的分離和活性檢測。本專利技術(shù)的胚胎干細(xì)胞檢測試劑盒除了用于鑒定胚胎干細(xì)胞全能性以外，還可同時(shí)用于檢測干細(xì)胞活性，拓展了檢測試劑盒的功能。附圖說明圖1為本專利技術(shù)實(shí)施例2中IHC染色結(jié)果示意圖。圖2為本專利技術(shù)實(shí)施例3中ICC染色結(jié)果示意圖；其中，ZjuESrMab29為篩選到的GM-CSFRα兔單克隆抗體。圖3所示為本專利技術(shù)實(shí)施例4中免疫沉淀(IP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本專利技術(shù)，但不用來限制本專利技術(shù)的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例1兔單克隆抗體的制備以小鼠胚胎干細(xì)胞(mES)作為免疫原，每次用I X IO8個(gè)mES免疫3月齡新西蘭大白兔，免疫4次，每次免疫間隔3周。四次免疫后取血清，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測陽性后靜脈注射I X IO8個(gè)mES細(xì)胞加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)3天后，分離兔脾臟細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞240E-W2(購自Epitomics公司)融合，篩選出產(chǎn)生GM-CSFRa兔單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株ZJUESRMAB29(保藏號CGMCC N0.7302)，應(yīng)用于干細(xì)胞的鑒定與分離。實(shí)施例2GM_CSFRa作為胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的應(yīng)用GM-CSFRa的表達(dá)隨細(xì)胞分化減少，在成體組織中局限表達(dá)，可作為新的胚胎干細(xì)胞鑒定標(biāo)志物。IHC染色實(shí)驗(yàn):準(zhǔn)備好各組織冷凍切片；將各組織冷凍切片置于3%過氧化氫中10分鐘，使內(nèi)源性過氧化物酶失活；冷凍切片用封閉液(含10%山羊血清和1%BSA的PBS)37°C封閉I小時(shí)；加入一抗(實(shí)施例1中制備的GM-CSFRa兔單克隆抗體)37°C孵育I小時(shí)；然后加入羊抗兔-HRP 二抗37°C孵育I小時(shí)；最后用新鮮配制的3，3' -diaminobenzidine (DAB)于37°C顯色5分鐘，觀察讀片。結(jié)果如圖1所示。IHC染色結(jié)果顯示=GM-CSFRa在小鼠睪丸中高表達(dá)，在腎臟和脾臟中弱表達(dá)，在腦、心、肝和肺中無表達(dá)，特異性高。實(shí)施例3GM_CSFRa作為胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的應(yīng)用ICC染色實(shí)驗(yàn)證明GM-CSFRa兔單抗可應(yīng)用于胚胎干細(xì)胞的鑒定與分選。ICC實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)細(xì)胞用4%甲醛(Sigma)于37°C固定1.5小時(shí)；然后用封閉液(含10%山羊血清和1%BSA的PBS)37°C封 閉I小時(shí)；封閉后的細(xì)胞加入一抗(實(shí)施例1中制備的GM-CSFRa兔單克隆抗體)37°C孵育I小時(shí)；PBS洗滌；洗滌后的細(xì)胞加入二抗37°C避光孵育45分鐘；最后用0.5 μ g/ml Hochest33258 (Sigma)核染色5分鐘；突光顯微鏡(OlympusIX-70)下觀察并拍照。結(jié)果如圖2所示。GM-CSFRa兔單抗ICC染色結(jié)果顯示:未分化的mES細(xì)胞與培養(yǎng)3天后分化的細(xì)胞對比，未分化的mES染色陽性，分化的mES染色陰性。實(shí)施例4GM_CSFRa作為胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物的應(yīng)用活細(xì)胞結(jié)合一免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明GM-CSFRa兔單抗識別天然構(gòu)象抗原。采用兩種方法進(jìn)行免疫沉淀(IP)實(shí)驗(yàn):1.1 經(jīng)典 IP (Classic IP)IO8個(gè)ES細(xì)胞采用RIPA裂解液裂解，與實(shí)施例1中制備的GM-CSFR α兔單抗充分混合，再使用ProA resin分離抗原抗體復(fù)合物,經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，銀染檢測。1.2 活細(xì)胞 IP (Live cell IP)IO8個(gè)ES活細(xì)胞與實(shí)施例1中制備的GM-CSFR α兔單抗充分混合，然后采用RIPA裂解液裂解，再使用ProA resin分離抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，銀染檢測。結(jié)果顯示:只有在活細(xì)胞IP條件下可以獲得特異性條帶，證明GM-CSFRa兔單抗識別天然構(gòu)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志物GM?CSFRα，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
【技術(shù)特征摘要】
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：宋秀麗，譚舟，張銘，顧斌，張佳蓉，侯倩女，
申請(專利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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