一種用米曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)蔗果低聚糖的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種用米曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)蔗果低聚糖的方法，它包括兩部分：（1）全細(xì)胞催化劑的制備，是將米曲霉孢子接種至種子培養(yǎng)基中，在一定的條件下制成種子液，再將種子液接種至產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在一定條件下制成全細(xì)胞菌體溶液；收集菌體，菌體經(jīng)過200-400目的濾布過濾、洗滌、再過濾、真空冷凍干燥后制成米曲霉全細(xì)胞；（2）利用上述的米曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)蔗果低聚糖，在一定條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化結(jié)束后的所得的糖液經(jīng)過過濾和真空濃縮得到蔗果低聚糖糖漿。本發(fā)明專利技術(shù)得到的產(chǎn)品經(jīng)高壓液相色譜法檢測(cè)，固形物中總低聚糖的含量≥50%，本發(fā)明專利技術(shù)的工藝簡(jiǎn)單，操作方便，酶活性高，轉(zhuǎn)化效率高，具有重要的工業(yè)價(jià)值。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于低聚糖的
，涉及蔗果低聚糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，具體涉及一種米曲霉全細(xì)胞生產(chǎn)蔗果低聚糖的方法。
技術(shù)介紹
低聚糖是以2-10個(gè)單糖分子通過糖苷鍵連接而成的低聚合度的碳水化合物，其中功能性的低聚果糖，又稱鹿果低聚糖(Fructooligosaccharides,縮寫為F0S),是由I 3個(gè)果糖基通過β_1，2糖苷健與蔗糖結(jié)合而生成蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的混合物。FOS具有促進(jìn)腸道內(nèi)例如雙歧桿菌的增殖，排毒清潔腸道，提高人體免疫力，改善脂質(zhì)代謝，能預(yù)防蛀牙，不被消化道吸收利用等優(yōu)異性能，現(xiàn)被廣泛用于保健食品配料中。目前生產(chǎn)蔗果低聚糖有兩種方法:(1)液體深層發(fā)酵法；(2)固定化酶法。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。液體深層發(fā)酵法需要投入大量的發(fā)酵設(shè)備及其附屬設(shè)備，前期投入非常大。液體深層發(fā)酵法，利用能分泌果糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物，從培養(yǎng)液分離收集菌絲體后，投入到蔗糖溶液中，在一定的條件下轉(zhuǎn)化為F0S。固定化酶的方法，因?yàn)楣潭ê蟮拿溉菀子坞x，且底物和產(chǎn)物要不斷穿過載體屏障，產(chǎn)率會(huì)受到很大的影響。專利號(hào)為01128345.9的中國專利技術(shù)專利主要利用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖，先培養(yǎng)出大量的菌絲體，將菌絲體破壁后將酶分離純化，再將酶與有機(jī)高聚物進(jìn)行交聯(lián)固定化后，用分批或柱式反應(yīng)法進(jìn)行固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖。該方法的不足之處是步驟繁多，酶容易失活，轉(zhuǎn)化率低，由于蔗糖和轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物要穿過固定化的顆粒，傳質(zhì)均勻性受到限制。由于酶的分離純化過程復(fù)雜且在此過程中酶活性有部分損失，在立體結(jié)構(gòu)環(huán)境中不穩(wěn)定，易失活等缺點(diǎn)，且酶的價(jià)格昂貴，造成酶法反應(yīng)成本較高，這些方面均嚴(yán)重制約了其的工業(yè)化應(yīng)用。固定化細(xì)胞法，即用海藻酸鈣凝膠將產(chǎn)酶菌體包埋起來的方法，該法不足之處是對(duì)生產(chǎn)環(huán)境和條件要求苛刻(例如空氣凈化)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)針對(duì)現(xiàn)有蔗果低聚糖轉(zhuǎn)化的酶制劑及其工藝上的不足，經(jīng)過多年攻關(guān)和探索，目的在于提供。該種全細(xì)胞酶制劑制備方法簡(jiǎn)單，不涉及到酶的分離純化。這種全細(xì)胞酶制劑具有轉(zhuǎn)化效率高，性能穩(wěn)定的特點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用了如下技術(shù)方案:，包括以下步驟:(2)米曲霉全細(xì)胞催化劑的制備；(2)利用米曲霉全細(xì)胞催化劑生產(chǎn)蔗果低聚糖。包括如下步驟:第一步:將米曲霉孢子接種到液體種子培養(yǎng)基中，接種量為I X IO5 101°個(gè)/L，于25_35°C,轉(zhuǎn)速為100r/min 300r/min的條件下培養(yǎng)16h 24h后的菌體溶液為種子液； 第二步:以體積比為5 10:100的比例，將第一步所得的種子液接種至含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，于25°C 35°C，轉(zhuǎn)速為100r/min 300r/min的條件下培養(yǎng)16 24h后的菌體溶液為全細(xì)胞菌體溶液；第三步:收集第二步所得的全細(xì)胞菌體溶液，用無菌的200目 400目的濾布過濾、洗滌、再過濾、脫水干燥去除水分，得到具有轉(zhuǎn)化活性的全細(xì)胞。第四步:以重量體積比為flO:100 (m/V)的比例，將第三步所得的全細(xì)胞FOS酶至于反應(yīng)體系中，于pH5.0-7.5、溫度45°C 55°C和轉(zhuǎn)速為100r/min 300r/min的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化24h 48h。第五步:反應(yīng)完成后，用板框過濾器過濾反應(yīng)液，回收全細(xì)胞菌體，濾過液經(jīng)過真空濃縮機(jī)濃縮成符合要求的FOS糖漿。利用高壓色譜法檢測(cè)反應(yīng)體系中蔗果低聚糖的含量，所得的蔗果低聚糖總量在50%以上。所述的液體種子培養(yǎng)基為；20g/L 50g/L蔗糖，3g/L 7g/L麥芽粉或10g/L 30g/L玉米粉,5g/L 10g/L蛋白胨或50g/L 100g/L的酵母提取物或其中兩種，lg/L 3g/L NaCl或lg/L 2g/LNaN03或其中的兩種。所述的產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑包括糖類化合物、無機(jī)鹽(K2HPO4, MgSO4.7H20、NaNO3)、酵母膏中的兩種或二種。所述的含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基為:10g/L 70g/L鹿糖，15g/L 55g/L玉米粉，20g/L 50g/L酵母提取物，Og/L 12g/L K2HP04，Og/L 1.5g/L MgS04.7H20，3g/L lOg/L NaN03。所述米曲霉是指由米曲霉CICC2134(Asperrgilus oryzae 2134,由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏，地址:北京市朝陽區(qū)霄云路32號(hào)，郵編:100027)。所述洗滌為用NaCl生理鹽水溶液。第三步采用真空冷凍干燥或真空干燥的方法去除水分，得到具有轉(zhuǎn)化活性的全細(xì)胞FOS酶。所得到的全細(xì)胞是能將蔗糖轉(zhuǎn)化為蔗果低聚糖。第四步采用Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04系列緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH為5.0-7.0。所述的反應(yīng)體系是重量百分比為40%_60% (w/w)的蔗糖溶液。本專利技術(shù)與現(xiàn)有的技術(shù)相比具有如下的優(yōu)點(diǎn):(I)本專利技術(shù)制作方法簡(jiǎn)單，不涉及到酶的繁雜分離純化的過程，簡(jiǎn)化了設(shè)備的投資。(2)米曲霉所需要的營養(yǎng)低，易培養(yǎng)，易操作，制作工藝簡(jiǎn)單，細(xì)胞體相當(dāng)于酶的天然保護(hù)層，可有效避免酶的失活，免去了酶固定化的步驟。(3)簡(jiǎn)化了蔗果低聚糖的生產(chǎn)工藝，直接將全細(xì)胞投入到反應(yīng)液中，減少了液體深層發(fā)酵培養(yǎng)中發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備的投入。(4)將全細(xì)胞FOS酶投入到FOS的反應(yīng)體系中，所得的FOS糖液不需要經(jīng)過脫色，不需要經(jīng)過離子交換柱脫鹽，只需要經(jīng)過簡(jiǎn)單的過濾，濃縮后即可得到固形物中總低聚糖的含量> 50%的FOS糖漿，整個(gè)工藝簡(jiǎn)單，操作方便，生產(chǎn)成本明顯降低。附圖說明圖1為本專利技術(shù) 實(shí)施例1中利用米曲霉全細(xì)胞制備蔗果低聚糖的高效液相色譜圖具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但是本專利技術(shù)要求保護(hù)的范圍并不局限于此。實(shí)施例1第一步將米曲霉CICC 2134(Aspergilusoryzae2134,由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏，地址:北京市朝陽區(qū)霄云路32號(hào)，郵編:100027)的孢子接種到液體種子培養(yǎng)基中，接種量為1父105個(gè)/1，于331:，轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上培養(yǎng)16h后的菌體溶液制成種子液；所述液體種子培養(yǎng)基配方為:20g/L蔗糖，30g/L玉米粉，100g/L酵母提取粉，2g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第二步:以體積比為5:100的比例，將第一步所得的種子液接種至產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，于33°C，轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上培養(yǎng)24h后的菌體溶液制成全細(xì)胞菌體溶液；所述的含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基為:70g/L蔗糖，20g/L酵母提取物，15g/L玉米粉，3g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第三步:收集第二步所得的全細(xì)胞菌體溶液，用無菌的200目的濾布過濾，用9g/L的NaCl溶液洗滌、再過濾，真空冷凍干燥，得到具有轉(zhuǎn)化活性的全細(xì)胞。第四步:以重量體積比為1:100 (m/V)的比例，將第三步所得的蔗果低聚糖的全細(xì)胞FOS酶至于反應(yīng)體系為重量百分比為50% (w/w)的鹿糖溶液中,將反應(yīng)體系pH調(diào)為5.0、于溫度為45°C和轉(zhuǎn)速為150r/min的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化24h。第五步:反應(yīng)完成后，用板框過濾器過濾反應(yīng)液，回收全細(xì)胞菌體，濾過液經(jīng)過真空濃縮機(jī)濃縮成符合要求的FOS糖漿。 根據(jù)國標(biāo)GB/T23528-2009低聚果糖中中的方法，利本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用米曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)蔗果低聚糖的方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）米曲霉全細(xì)胞催化劑的制備；（2）利用米曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)蔗果低聚糖。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉冬梅，周康，范夢(mèng)柯，葉嘉倫，韋健軍，周偉文，韋勝軍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中山市比克生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：