一種利用棕繩固定化細胞連續制備β-環糊精的方法，屬于β-環糊精生產技術領域。本發明專利技術用棕繩編織成棕簾再經處理過，將環糊精糖基轉移酶CGTase產生菌ATCC21783固定在棕簾上，搖瓶生產CGTase，每隔2-3天將棕簾取出，用生理鹽水清洗，洗去棕簾上的衰老退化菌落，重新投放到新鮮的培養基中繼續培養；發酵產生的CGTase按照工業化步驟用于β-環糊精生產。棕簾固定化細胞使CGTase連續化產生，進而實現β-環糊精的連續化生產，該過程可持續一個月以上。本發明專利技術首次采用棕繩這一天然易得材料作為固定化基質，用于固定化CGTase產生菌，固定化過程簡單，連續化生產效果顯著；與現有β-環糊精制備工藝相比，縮短菌種產酶周期，簡化β-環糊精制備工藝，提高生產效率。
【技術實現步驟摘要】
—種利用棕繩固定化細胞連續制備P-環糊精的方法
一種利用棕繩固定化細胞連續制備￠-環糊精的方法，屬于￠-環糊精生產
技術介紹
環糊精(cyclodextrin,⑶)稱作環聚葡萄糖又名環鏈淀粉，Viller在1891年通過軟化芽孢桿菌作用于淀粉，經酶降解所得產物而發現了環糊精。由于環糊精具有內疏水外親水的筒狀結構，使其具有很多特別的性能，能與范圍極其廣泛的各類客體，比如有機分子、無機離子、配合物甚至惰性氣體，通過分子間相互作用形成主客體包合物，從而對客體具有屏蔽、控制釋放、活性保護等功能，因而廣泛應用到醫藥和食品領域。P -環糊精制備工藝簡單，成本較低，是目前國內唯一工業化生產的環糊精。酶法制備￠-環糊精，安全污染小，是國外內制備環糊精的主要方法。但是，酶法制備P _環糊精過程中，由于影響菌種生長因素較多，造成菌種生長速度很不穩定，使得整個生產過程周期難以估算控制，造成嚴重的原料浪費和能源浪費，增加了生產成本。固定化細胞的方法，可以增加菌種的生長穩定性，縮短種子液生長周期，并且能夠反復多次使用菌種，從而使得環糊精的生產具有持續性，降低成本。國外已有固定化細胞的相關報道，報道結論證實了固定化細胞對于維持環糊精糖基轉移酶(CGTase)的連續活性具有重要作用。國內尚無相關報道。本專利技術首次采用棕繩這一天然易得材料作為固定化基質，用于固定化CGTase產生菌，利用細菌對于棕繩的天然附著力實現細胞固定化，固定化過程簡單，連續化生產效果顯著，為工業連續化生產CGTase以及P -環糊精提供依據。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種利用棕繩固定化細胞連續制備P -環糊精的方法，增加環糊精生產周期的可控性，降低生產成本。本專利技術的技術方案:一種利用棕繩固定化細胞連續制備￠-環糊精的方法，以棕繩固定化細胞，實現環糊精糖基轉移酶CGTase連續培養，從而實現P -環糊精的連續化制備，步驟為: (1)制備固定化基 質棕簾:棕繩編織成簾，棕簾需要先用0.3%-0.5%Na0H溶液浸泡24h，再經煮沸4-6h，121°C 20min滅菌，待用； (2)種子培養:采用菌株ATCC21783為CGTase產生菌，投放入培養基中，培養基為:可溶性淀粉1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.02%,碳酸鈉1%，其余為凈水，調整pH8.5 ；200rpm搖床培養3天，待光密度達到0.8，作為種子液； (3)棕繩固定化培養:培養基中接種1%_3%的光密度為0.8的種子液，投放棕簾，棕簾比表面積與培養基體積的比為1:3-2:3 (cm2:mL)，pH8.5，29°C，200rpm搖床培養；培養2_3天后，至光密度達到1.0 ； (4)CGTase連續培養:無菌條件下將棕簾取出，首次培養發酵液離心除菌后用以制備β -環糊精；取出的棕簾用滅過菌的0.9%的生理鹽水沖洗，投入新鮮配制、121 °C 20min滅菌的培養基中，繼續在與步驟(3)相同的條件下培養24-48h，得CGTase酶液； (5)按步驟(4)中所述方法取出棕簾，投放到下個循環中繼續使用；此次及以后所得發酵液無需離心，可直接做CGTase粗酶液催化淀粉制備β -環糊精； 經10-15個循環后，酶活仍可保持為初酶活的80%-90% ； (6)β-環糊精的連續化制備:將所得的酶按照無溶劑法制備環糊精的方法，生產制備環糊精。本專利技術的有益效果:一是實現菌種的反復利用，增加了菌種的生長穩定性，縮短種子液長成時間，因而使得整個生產過程具有可控性及連續性。二是固定菌的可操作性強，操作簡單，基本可免去分離純化酶液的過程，簡化了生產過程。三是酶活力相對穩定，在連續生產過程中，并沒有因為使用周期的延長而造成酶活力的大幅降低。這就保證了連續化生產過程中環糊精產量的穩定性。四是整個生產周期穩定，利于及時合理的安排各生產階段工作，減少了對原材料及能源的損耗，降低了成本。附圖說明圖1連續發酵酶液催化淀粉制備β -環糊精的框圖。具體實施例方式實施例1 反應體系中，CGTase產生菌采用菌株ATCC 21783 (購自美國模式菌種收集中心、或上海復祥生物科技有限公司)，使用堿性培養基(`可溶性淀粉1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.02%,碳酸鈉1%，調整ρΗ8.5，200rpm搖床培養3天，待光密度達到0.8，接種量為1%，投放棕簾。棕簾需要先用0.3%-0.5%Na0H浸泡24h，再經煮沸4_6h，12rC，20min，單獨滅菌。棕簾比表面積與培養基體積的比為l:3(cm2:mL)，pH8.5, 29°C,200rpm搖床培養。培養3天后，再配制新的培養基和0.9%的生理鹽水，121°C，20min,滅菌。將棕簾取出，發酵液測酶活，制備環糊精。用生理鹽水沖洗棕簾，將沖洗后的棕簾再放入新的培養基中。同樣條件培養2天，再取出，同第一次操作；再同樣條件培養2天，此過程重復10次，發酵后均測酶活，第一次酶活為5212.64U (0D值降低1/10為一個酶活單位)，第10次酶活為4218.30U，酶活依然為首次發酵測定酶活的80.9%。實施例2 反應體系中，CGTase產生菌采用菌株ATCC 21783，使用堿性培養基(可溶性淀粉1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.02%,碳酸鈉1%，ρΗ8.5，200rpm搖床培養3天，待光密度達到0.8，接種量為2%，投放棕簾。棕簾需要先用0.3-0.5%Na0H浸泡24h，再經煮沸4-6h，121 V，20min,單獨滅菌。棕簾比表面積與培養基體積的比為2:3 (cm2:mL)，ρΗ8.5，29°C，200rpm搖床培養。培養3天后，再配制新的培養基和0.9%的生理鹽水，121°C，20min，滅菌。將棕簾取出，發酵液測酶活，制備環糊精。用生理鹽水沖洗棕簾，將沖洗后的棕簾再放入新的培養基中。同樣條件培養2天，再取出，同第一次操作；再同樣條件培養2天，此過程重復10次，發酵后均測酶活，第一次酶活為5207.98U (0D值降低1/10為一個酶活單位)，第10次酶活為4472.71U，酶活為首次發酵測定酶活的85.88%。權利要求1.，其特征在于以棕繩固定化細胞，實現環糊精糖基轉移酶CGTase連續培養，從而實現β -環糊精的連續化制備，步驟為: (1)制備固定化基質棕簾:棕繩編織成簾，棕簾需要先用0.3%-0.5%NaOH溶液浸泡24h，再經煮沸4-6h，121°C 20min滅菌，待用； (2)種子培養:采用菌株ATCC21783為CGTase產生菌，投放入培養基中，培養基為:可溶性淀粉1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.02%,碳酸鈉1%，其余為凈水，調整pH8.5 ；200rpm搖床培養3天，待光密度達到0.8，作為種子液； (3)棕繩固定化培養:培養基中接種1%_3%的光密度為0.8的種子液，投放棕簾，棕簾比表面積與培養基體積的比以cm2:mL計為1:3-2: 3，pH8.5，29°C，200rpm搖床培養；培養2_3天后，至光密度達到1.0 ； (4)CGTase連續培養:無菌條件下將棕簾本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種利用棕繩固定化細胞連續制備β?環糊精的方法，其特征在于以棕繩固定化細胞，實現環糊精糖基轉移酶CGTase連續培養，從而實現β?環糊精的連續化制備，步驟為：（1）制備固定化基質棕簾：棕繩編織成簾，棕簾需要先用0.3%?0.5%NaOH溶液浸泡24h，再經煮沸4?6h，121℃?20min滅菌，待用；（2）種子培養：采用菌株ATCC?21783為CGTase產生菌，投放入培養基中，培養基為：可溶性淀粉1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.02%，碳酸鈉1%，其余為凈水，調整pH8.5；200rpm搖床培養3天，待光密度達到0.8，作為種子液；（3）棕繩固定化培養：培養基中接種1%?3%的光密度為0.8的種子液，投放棕簾，棕簾比表面積與培養基體積的比以cm2:mL計為1:3?2:3，pH8.5，29℃，200rpm搖床培養；培養2?3天后，至光密度達到1.0；（4）CGTase連續培養：無菌條件下將棕簾取出，首次培養發酵液離心除菌后用以制備β?環糊精；取出的棕簾用滅過菌的0.9%的生理鹽水沖洗，投入新鮮配制、121℃?20min滅菌的培養基中，繼續在與步驟（3）相同的條件下培養24?48h，得CGTase酶液；（5）按步驟（4）中所述方法取出棕簾，投放到下個循環中繼續使用；此次及以后所得發酵液無需離心，可直接做CGTase粗酶液催化淀粉制備β?環糊精；經10?15個循環后，酶活仍可保持為初酶活的80%?90%；（6）β?環糊精的連續化制備：將所得的CGTase酶按照無溶劑法制備β?環糊精的方法，生產制備β?環糊精。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：金征宇，岳艷，王金鵬，周星，焦愛權，王亞敏，趙建偉，徐學明，謝正軍，田耀旗，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
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