本發明專利技術公開了針對小窩蛋白2、表面活性蛋白D的siRNA及重組載體；含有轉錄因子A、對氧磷酸酶3轉錄盒重組載體的構建方法和相應的細胞模型和篩選藥物的方法。本發明專利技術優點在于，所提供的siRNA使經其轉染后的哺乳動物細胞的mRNA或蛋白表達下降60％以上；該siRNA和重組載體可用于基因治療流感或針對流感病毒進行核酸免疫；本發明專利技術提供的細胞模型，可用于病毒研究，特別是豬流感病毒致病機理研究，也可用于建立篩選抗病毒藥物模型，特別是抗流感藥物細胞模型。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
，特別涉及抑制小窩蛋白2和表面活性蛋白D基因表達的siRNA、siRNA的核苷酸序列、可編碼該siRNA的重組載體以及可編碼轉錄因子A和對氧磷酸酶3的重組載體，以及它們各自的基因在制備和篩選抗流感藥物方面的用途。
技術介紹
病毒入侵宿主過程伴隨著宿主基因表達變化，最終決定感染細胞和病毒各自的命運。病毒感染宿主后需要利用宿主細胞的代謝過程完成病毒自身的復制，在這一過程病毒必然會調控宿主細胞內基因組的表達，抑制抗病毒基因表達，增強對病毒復制有益的基因表達。因此，病毒感染宿主細胞后，宿主細胞內表達變化的這些基因往往和病毒復制有密切的關系。通過生物學手段調控宿主細胞內這些基因中一個或同時調控多個基因表達可能具有抑制流感病毒復制的作用，具有潛在預防和治療流感病毒感染的應用價值。流感病毒為正粘病毒科流感病毒屬分節段單股負鏈RNA病毒。病毒粒子剛分尚時呈多晶形，在體內傳代后變成球形，直徑80-120nm(PaleSe，et al.，2007)。病毒粒子由0.8-1 %的RNA、70-75%的蛋白質、20%的脂類和5_8%的糖類組成，此處比例均為質量比。流感病毒分為A、B、C三型，其中A型(甲型)最為重要。甲型流感病毒能引起人類、豬、馬和各種禽類的自然感染和發病。由于其表面抗原HA和NA容易變異，已知HA有16個亞型(H1-H16)，NA有9個亞型(N1-N9)，它們之間的不同組合，使甲型流感病毒有許多亞型(如H1N1、H2N2、H3N2、H5N1等)，在豬體中主要流行HlNl和H3N2亞型。不同動物有不同的流感病毒，如豬流感、人流感、馬流感，一般情況下這些流感只感染各自的本屬動物。但是，流感病毒具有宿主種的適應性。在不同種動物的個體之間也容易發生傳播，形成感染多種動物的新流感病毒。另一個特點是豬這種動物比較特殊，豬對其它動物的流感病毒也易感，這是其它動物不具有的特性。所以一旦豬同時感染了人流感、豬流感、禽流感等，這多種病毒會在豬體內發生重組，可能就會出來一種既能感染豬、人、禽的流感病毒。所以狹義的豬流感不是人獸共患病。流感在人與人之間傳播范圍很有限，跟流感的傳播途徑有關。比如2009年甲型流感，就是人流感、豬流感、禽流感共同感染豬后產生的新流感病毒，最開始感染的人基本都是接觸過或跟豬關系密切的人，隨后會有更多人感染流感病毒。人類發展史上流感病毒的大爆發都給社會經濟發展、人的健康帶來重大危害。為預防和治療流感，各國都投入了大量人力物力，不斷研究治療方法和藥物。近年來，從宿主細胞內尋找具有抗病毒功能的基因或蛋白是一個熱門領域。人類發展史上流感病毒的大爆發都給社會經濟發展、人的健康帶來重大危害。為預防和治療流感，各國都投入了大量人力物力，不斷研究治療方法和藥物。近年來，針對宿主細胞內具有抗病毒功能的基因或蛋白作為靶點研發抗病毒藥物是一個熱門領域。以細胞內功能分子作為抗病毒治療的靶點具有廣譜抗病毒、不易產生耐藥毒株的優勢，逐漸成為研究開發抗病毒治療藥物的熱點途徑。近年來國際高水平論文多次報道在宿主細胞內信號通路中篩選具有潛在抗病毒功能的分子取得突破性成就。例如， 鋅指抗病毒蛋白(Zinc-finger antiviral protein, ZAP)能通過降解特異病毒RNA進而抑制鼠白血病病毒等多種病毒的復制，被證明是一種重要的抗病毒因子(Chen et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A.105，4352-4357)。利用鋅指蛋白為載體攜帶特異的酶阻斷T細胞中的 CCR5 表達，可促進 T 細胞清除 HIV 病毒(Holt et al.(2010)Nat.Biotechnol.28，839-847) <^3泛素連接酶RNF5定位于線粒體，通過泛素化修飾MITA (也稱為STING)并引起其降解而負調控病毒感染后I型干擾素表達(Zhong et al.(2009) Immunity.30,397-407)。Tetherin (宿主細胞蛋白)以二聚體錨定HIV在其復制的細胞膜上，阻斷病毒從胞漿膜出芽釋放(Perez-Caballero et al.(2009)Cell.139，499-511)。AP0BEC3G(ApolipoproteinBmRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G)可誘導HIV基因變異，使病毒不能復制(Shirakawa et al.(2008) Nat.Struct.Mol.Biol.15,1184-1191)。目前細胞周期素依賴激酶、前列腺素、熱休克蛋白作為藥靶分子廣泛用于如，HCMV、HIV、HSV、腺病毒和乳頭狀瘤等病毒病治療。RNAi是一種高效的特異性強的基因阻斷技術，近年來發展迅速，很快就成為功能基因組研究的有力工具。通過實驗手段將dsRNA分子導入細胞內，特異性地降解細胞內與其序列同源的mRNA，封閉內源性基因表達，從反向遺傳的角度研究人類或其他生物基因組中未知基因的功能。早期就有人應用此項技術分離了果蠅胰島素信號轉導途徑通路中的各種成分。近來也有實驗報道通過RNAi研究細胞內脂質平衡過程中涉及的各條途徑。在這之前，曾利用反義RNA與靶mRNA序列互補的特性來抑制其表型的發生，但由于反義RNA對內源性表達的基因抑制作用較弱，往往會產生一些過渡表型，易造成對基因功能判斷錯誤，目前已通過審批認為臨床上具有治療作用的僅有一種藥物Vitravene。RNAi特異性更高，作用更迅速，副反應小，在有效地沉默靶基因的同時，對細胞本身的調控系統也沒有影響。最近在人類體細胞里已經成功地對近20種基因功能進行了“敲除”，尤其是因此而了解了人類空泡蛋白TsglOl對HIV在人體內增殖的作用，進一步深化了對HIV的研究。Leonid等以脊髓灰質炎病毒為模型，利用RNAi來誘導細胞的胞內免疫，產生抗病毒效應，尤其是針對RNA病毒。對于易突變的病毒，可設計多種靶向病毒基因保守序列的dsRNA，減少它對dsRNA的抵抗。Maen等也應用RNAi技術成功地阻斷了 MCF-7乳腺癌細胞中一種異常表達的與細胞增殖分化相關的核轉錄因子基因21的功能。RNAi技術的應用，不僅能大大推動人類后基因組計劃(蛋白組學)的發展，高通量地篩選藥物靶基因，逐條檢測人類基因組的表達抑制情況來明確基因的功能，并且它還將應用于基因治療、新藥開發、生物醫學研究等領域，用RNAi技術來抑制基因的異常表達，為治療各種疾病開辟了新的途徑。由于近年來分子生物學技術和細胞生物學技術的快速發展，分子藥理學研究也不斷深入，新的藥物作用靶點、功能蛋白質、基因表達的變化，生物活性成分等不斷發現，為藥物篩選提供了大量新的靶點，如新的受體、酶等。這些新的靶點為新藥篩選提供了新的信息和機會。細胞分子水平藥物篩選模型的應用為自動化操作奠定了基礎，使藥物篩選由傳統的手工篩選形式轉變為由計算機控制的自動化大規模篩選的新技術體系，形成了高通量藥物篩選。高通量藥物篩選的優點:實現了藥物篩選的規模化，較大限度地利用了藥用物質資源，提高了藥物發現的概率， 同時提高了發現新藥的質量；篩選實驗是在微量篩選系統中完成的，樣品用量一般在微克級(μ g)，節省了樣品本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種針對小窩蛋白2基因的siRNA，其特征在于，所述的siRNA對應的靶序列是小窩蛋白2基因的mRNA，所述的siRNA的長度為16?30bp，且可使經其轉染后的哺乳動物細胞的mRNA或蛋白表達下降60％以上。
【技術特征摘要】
1.一種針對小窩蛋白2基因的siRNA，其特征在于，所述的SiRNA對應的靶序列是小窩蛋白2基因的mRNA，所述的siRNA的長度為16_30bp，且可使經其轉染后的哺乳動物細胞的mRNA或蛋白表達下降60%以上。2.如權利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA含有SEQID NO:1所示的核苷酸序列。3.如權利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA如序列表中SEQID ΝΟ:1表/Jn ο4.一種針對表面活性蛋白D基因的siRNA，其特征在于，所述的siRNA對應的靶序列是表面活性蛋白D基因的mRNA，所述的siRNA的長度為16_30bp，且可使經其轉染后的哺乳動物細胞的mRNA或蛋白表達量下降60%以上。5.如權利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA含有選自SEQID NO:2所示的核苷酸序列。6.如權利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA序列如序列表中SEQIDNO:2表示。7.如權利要求2或5所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA序列3’端還含有2個T或含有2個U的延伸結構。8.如權利要求1-7任一項所述的siRNA在制備或篩選抗流感藥物中的用途，或者在抑制流感病毒復制中的用途。9.一種含有轉錄因子A的基因開放閱讀框的重組載體，其特征在于，由包括以下步驟的方法制備， (1)在Genbank中登錄號為ΝΜ_001130211.1的轉錄因子A基因序列中，選取序列中從起始密碼子“ATG”到終止密碼子“TGA”、“TAG”或“TAA”之間最長的序列741bp堿基； (2)分別在5'和3'端設計擴增全長PCR引物，上游引物5'端添加HindIII酶切位點，CGG作為保...
【專利技術屬性】
技術研發人員：馬志永，史子學，魏建超，邵東華，王少輝，李蓓蓓，晏文君，朱紫祥，
申請(專利權)人：中國農業科學院上海獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：
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