本發明專利技術公開了一種針對人fascin-1基因的siRNA及其應用，屬于生物工程技術領域，解決腫瘤細胞fascin-1惡性增殖、侵襲、轉移的問題。一種針對人fascin-1基因的siRNA，包括以下序列：正義鏈：5′-CGACTATAACAAGGTGGCCATtt-3′；反義鏈：5′-ATGGCCACCTTGTTATAGTCGtt-3′。本發明專利技術針對fascin-1基因表達的siRNA，可抑制腫瘤細胞惡性增殖、侵襲、轉移的惡性生物學表型，可廣泛用于抑制人腫瘤細胞系的惡性表型研究，用于制備治療抗腫瘤的生物靶向制劑或者藥物。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程
，涉及一種針對人fascin-Ι基因的siRNA及其應用。
技術介紹
喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，起源于喉黏膜上皮，病死率較高。據北美和歐洲流行病學研究顯示，其發病率為7.0-13.2/10萬人，近20年呈上升趨勢。在腫瘤細胞的生物學特征中，以侵襲轉移最為關鍵。據臨床統計，有80%以上的腫瘤患者死于侵襲轉移，而未有侵襲轉移者，則預后較好。然而喉腔由于其解剖結構局限，并具有豐富淋巴組織等特點，使得喉鱗癌具有局部浸潤及頸部淋巴結轉移的惡性生物學行為，使得局部復發及轉移成為患者5年內死亡的主要原因。fascin-1 (FSCN1)即聚束蛋白，是一種肌動蛋白結合蛋白，定位于染色體7p22,分子量為55kD，有兩個與F-肌動蛋白結合位點，可通過增加細胞膜突起、改變細胞與細胞外基質的粘附以及通過細胞信號傳導通路等途徑促進腫瘤細胞侵襲轉移。Exp Cell Res.2002，275(1):92-109.和 Gene Expr Patterns.2004，4(6):637-643 記載了現已知人類fascin有3種不同形式:fascin_l,主要表達于間葉組織和神經系統；fascin_2,特異表達于視網膜；fascin-3,在睪丸中特異表達。細胞骨架對上皮細胞遷移和黏附具有重要作用，在上皮源性腫瘤侵襲和轉移過程中，細胞骨架不僅會重組變化，還可導致胞內信號傳導異常，成為惡性增殖及侵襲轉移的重要初始因素。fascin-Ι作為細胞骨架結構中的重要分子，不僅在腫瘤細胞多種惡性生物學行為中發揮重要作用，還與患者不良臨床病理特征及預后相關。研究發現fascin-Ι在乳腺、卵巢、胰腺、胃、膽管、結腸等正常被覆單層柱狀上皮中呈陰性表達，在食管復層鱗狀上皮中，僅在基底層細胞中呈低表達，上層細胞中未見表達。fascin-Ι在交界性、原發性及轉移性卵巢癌上皮病變中均出現表達，尤其是在轉移性卵巢癌中表達更為彌漫；其在非小細胞肺癌中表達上調，并與腫瘤分化程度呈正相關，在大多血管癌栓中特有而普遍表達，尤其在發生對側胸或遠處轉移的肺腺癌中與fascin-Ι彌漫表達明顯相關；在結腸原位癌、浸潤至肌層、全層癌組織，fascin-Ι表達逐漸增強，并且有區域淋巴結轉移的結直腸癌中fascin-Ι表達陽性率明顯高于無淋巴轉移組，尤其是轉移癌中fascin-Ι表達水平高于原位癌；在食管癌中fascin-Ι高表達與患者預后、腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移相關。因此，fascin-Ι的確與上皮源性腫瘤的惡性程度及侵襲轉移等惡性進展過程密切相關，fascin-Ι與喉鱗癌侵襲轉移、復發及預后不良相關。RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA(double_stranded RNA, dsRNA)引發的轉錄后基因沉默機制。其作用機制是=RNase III核酶家族的Dicer，與雙鏈RNA結合，將其剪切成21-23nt及3'端突出的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA),隨后siRNA與RNA誘導沉默復 合物(RNA-1nduced silencing complex, RISC)結合,解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導，序列特異性地結合在靶mRNA上并將其切斷，引發靶mRNA的特異性分解，從而阻斷相應基因表達的轉錄后基因沉默機制。RNAi已作為一種簡單有效的基因敲除的技術，廣泛地應用于功能基因組學的研究中。然而目前還沒有針對fascin-Ι基因設計的siRNA報道。申請人為了對腫瘤細胞fascin-Ι進行干擾,設計了針對fascin-Ι基因的siRNA,從而抑制腫瘤細胞惡性增殖、侵襲、轉移的惡性生物學表型，可能成為腫瘤靶向治療的有藥物。
技術實現思路
本專利技術是為了解決腫瘤細胞fascin-Ι惡性增殖、侵襲、轉移的問題，而提供了一種針對人fascin-Ι基因的siRNA及其應用，從而達到抑制其惡性增殖、侵襲、轉移的惡性生物學表型，可能成為腫瘤靶向治療的有藥物的目的。本專利技術針對fascin-Ι基因設計siRNA,通過干擾技術,抑制fascin-Ι表達，通過突光實時定量PCR(qRT-PCR)，通過包含細胞活力、克隆形成、黏附能力、侵襲能力、遷移能力的細胞功能實驗，評價本專利技術siRNA的沉默靶向基因fascin-Ι效果。本專利技術是通過以下技術方案實現的: 一種針對人fascin-Ι基因的siRNA，其序列為: 正義鏈:5' -CGACTATAACAAGGTGGCCATtt-3' 反義鏈:5' -ATGGCCACCTTGTTATAGTCGtt-3'。進一步地，所述的3'端懸掛由脫氧核苷組成的堿基TT，用于提高基因沉默效率以及siRNA的穩定性。本專利技術還進一步提供了將上述siRNA在制備治療抗腫瘤的生物靶向制劑或者藥物上的應用。fascin-Ι的RNA序列如序列I所示。與現有技術相比，本專利技術針對fascin-Ι基因表達的siRNA，可抑制腫瘤細胞惡性增殖、侵襲、轉移的惡性生物學表型，可廣泛用于抑制人腫瘤細胞系的惡性表型研究，用于制備治療抗腫瘤的生物靶向制劑或者藥物。附圖說明圖1:原始狀態下Hep-2及HOK細胞株中fascin-Ι相對表達量柱狀 圖2:N0.1-3 fascin-1 siRNA轉染Hep-2后fascin-1相對表達量柱狀 圖 3:N0.1-3 fascin-1 siRNA 對 fascin-1 敲減率柱狀 圖4:Hep-2轉染siRNA NC后粘附圖 5:Hep-2 轉染 N0.3 siRNA fascin-Ι 后粘附 圖6:Hep-2轉染siRNA NC后遷移能力 圖7:Hep-2轉染N0.3 siRNA fascin-Ι后遷移能力 圖8:Hep-2轉染siRNA NC后侵襲能力 圖9:Hep-2轉染N0.3 siRNA fascin-Ι后侵襲能力 圖10:Hep-2轉染N0.3 siRNA NC后平板克隆能力 圖11:Hep-2轉染N0.3 siRNA fascin-Ι后平板克隆能力 圖12:!fep-2 分別轉染siRNA NC及N0.3 siRNA fascin-Ι后細胞活力曲線圖。具體實施例方式本申請所涉及的全部實驗經過山西醫科大學科學研究倫理委員會批準。實施例1 fascin-Ι蛋白在喉鱗癌組織及對應正常癌旁黏膜組織中的表達 石蠟包埋組織行4 ym連續切片，脫蠟后水化；置檸檬酸鹽緩沖液高壓修復，3%過氧化氫甲醇溶液封閉10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次；加封閉液10 min，一抗4°C孵育過夜；PBS Tween 20液洗3次，二抗孵育15 20 min，PBS洗3次，二氨基聯苯胺(DAB)顯色；蘇木素復染并脫水封片；PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性標本肺鱗癌作陽性對照，血管內皮細胞作內對照；鼠抗人單抗fascin-1 (MS-1112)購自美國賽默飛世公司；MaxVision羊抗鼠二抗為福州邁新產品，封閉血清及DAB為武漢博士德產品。免疫組化評價標準:fascin_l:陽性細胞< 10%，I分；11% 50%，2分；51% 80%，3分；> 81%，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種針對人fascin?1基因的siRNA，其特征在于，包括以下序列：正義鏈：5′?CGACTATAACAAGGTGGCCATtt?3′反義鏈：5′?ATGGCCACCTTGTTATAGTCGtt?3′。
【技術特征摘要】
1.一種針對人fascin-1基因的siRNA,其特征在于,包括以下序列: 正義鏈:5' -CGACTATAACAAGGTGGCCATtt-3' 反義鏈:5' -ATGGCCACCTTGTTATAGTCGtt-3'。2.根據權利要求1所...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王斌全，高偉，張春明，溫樹信，皇甫輝，陳鋼鋼，張海利，
申請(專利權)人：山西醫科大學第一醫院，
類型：發明
國別省市：
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