用于治療病毒感染的dsRNA制造技術

本發明專利技術是用于治療病毒感染的dsRNA。涉及靶向磷脂酰肌醇4-激酶（PI4K）的基因表達的雙鏈核糖核酸（dsRNAs），尤其涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽（PIK4CB）或人磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽（PIK4CA）的雙鏈核糖核酸（dsRNAs），并涉及它們用于治療由正鏈RNA病毒如丙型肝炎病毒（HCV）所致感染的用途。每一dsRNA包含具有這樣的核苷酸序列的反義鏈，所述核苷酸序列長度短于30個核苷酸、通常長19-25個核苷酸，并且基本互補于PIK4CB靶mRNA或PIK4CA靶mRNA的至少一部分。許多這樣的dsRNA可用于提供治療益處。本發明專利技術也涉及包含dsRNA和可藥用載體的藥物組合物，并且包括遞送形式如完全包封的脂質體或脂類復合體。

【技術實現步驟摘要】
用于治療病毒感染的dsRNA本申請是中國專利申請200880023497.1的分案申請，原申請的申請日是2008年7月4日，專利技術名稱是“用于治療病毒感染的dsRNA”。專利
本專利技術涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，尤其涉及靶向人磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB ；ΝΜ_002651)和/或人磷脂酰肌醇4-激酶α多肽(PIK4CA ;ΝΜ_002650)的雙鏈核糖核酸，并涉及其在治療由正鏈RNA病毒如丙型肝炎病毒(HCV)感染介導的病理過程中的用途。專利技術背景RNA依賴的RNA聚合酶正鏈RNA病毒形成了由許多不同亞家族組成的大的病毒超家族。這些病毒涵蓋植物界和動物界兩界，引起的病理學范圍從輕微的表型到嚴重的衰弱疾病。正鏈RNA病毒聚合酶超群的構成如下。1.小RNA病毒組(HAV、脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒)、諾達病毒(nodaviruses)、紅豆花葉病毒屬(comoviruses)、線蟲傳多面體病毒組(nepoviruses)、馬鈴薯Y病毒組(potyviruses)、大麥花葉病毒組(bymoviruses)、南方菜豆花葉病毒組(sobemoviruses)和黃癥病毒組(Luteoviruses)(黃化病毒、黃矮病毒和卷葉病毒)。I1.香石竹斑駁病毒組(Carmoviruses)、番爺叢矮病毒組(tombusviruses)、香石竹環斑病毒組(dianthoviruses)、痕病毒屬(pestiviruses)、披膜病毒(togaviruses)、伊科病毒(echoviruses)、登革病毒、丙型肝炎病毒、黃病毒屬(flaviviruses)。II1.煙草花葉病毒組(Tobamoviruses)、煙草脆裂病毒組(tobraviruses)、大麥病毒組(hordeiviruses)、tricornaviruses> 甲病毒、風疫病毒屬(rubiviruses)、真菌傳桿狀病毒組(furoviruses)、戍型肝炎病毒、馬鈴薯X病毒組(potexviruses)、香石竹潛病毒組(carlaviruses)、蕪菁黃花葉病毒組(tymoviruses)和蘋果褪綠葉斑病毒。正鏈RNA病毒的基因組編碼RNA依賴的RNA聚合酶，所述RNA聚合酶是唯一含有這類病毒中保守基序的病毒蛋白。由于這類病毒含有顯著的系統發育變異性，所以該保守性是意義重大的，人們預計存在病毒感染細胞和維持穩定復制的多種方式。除許多不同之外，該類中的所有病毒都依賴RNA依賴的正鏈RNA轉錄這一單個基本步驟。由于該步驟對病毒生活周期是必需的，所以病毒使用許多宿主蛋白質來啟動和維持RNA依賴的RNA聚合酶活性。不與宿主因子相互作用，則病毒不能存活。因此，可用于抑制病毒感染的治療介入將是阻斷病毒宿主的相互作用。如果宿主因子對病毒是必需的，但對宿主不是必需的，那么可操縱這些宿主因子，便可實現阻斷病毒感染的能力。已經證實，靶向宿主蛋白質是干擾HIV、HCV、天花病毒等病毒感染和復制的有效方法。正鏈RNA病毒的重要性是對人類健康和生存力的影響。幾種正鏈RNA病毒感染人類，并在許多情況下導致使人虛弱的疾病和/或病態。幾種對人類健康造成特別的負擔的病毒是登革病毒(出血熱)、HCV (慢性肝病、肝功能衰竭、纖維樣變性和癌)和HEV (暴發性肝功能衰竭)。由這 些病毒引起的肝臟和血液疾病導致全世界數以百萬的死亡，并且花費醫療工業數十億美元用于肝臟相關的疾病。找到控制病毒感染的治療方法的意義重大，并且可改善全世界人類健康。因此，存在有效治療由HCV和其它正鏈RNA病毒(以上所列)引起的感染這一未滿足的需求。該說明書也涉及雙鏈RNA分子(dsRNA)。已經表明，dsRNA以已知為RNA干擾(RNAi)的高度保守性調節機制來阻斷基因的表達。W099/32619 (Fire等人)公開了至少長25個核苷酸的dsRNA在秀麗線蟲(C.elegans)中抑制基因表達的用途。也已經表明，dsRNA在其它生物體包括植物(參見例如W099/53050, Waterhouse等人；和W099/61631, Heifetz等人)、果蠅(參見例如Yang, D等人，Curr.Biol.(2000) 10:1191-1200)和哺乳動物(參見W000/44895, Limmer ;和 DE10100586.5, Kreutzer 等人)中降解祀 RNA。現在，這種天然機制已經成為研發治療由于基因異常或不想要的調節引起的病癥的新型藥劑的焦點。PCT 公開號 W02003016572、W02003070750 和 W02005028650 中公開了先前研發治療由HCV感染引發的疾病的、基于核酸的RNAi藥物的努力。PCT公開號W02006074346中公開了使用RNAi藥物治療RSV感染的先前的努力。盡管在RNAi領域有顯著進步，并且在治療由病毒感染介導的病理過程中有進展，但仍然需要能夠抑制病毒感染進程、并且能夠治療與病毒感染相關的疾病的藥劑。本專利技術公開了滿足這種需要的化合物、組合物和方法，并提供了其它益處。專利技術概述本專利技術提供了用于治療正鏈RNA病毒(如HCV、HPV、登革病毒和脊髓灰質炎病毒)感染的組合物和方法，所述組合物和方法通過降低細胞中(其中這類病毒可復制，如肝臟)人宿主因子磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB;NM_002651)和/或磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA;NM_002650)的活性的水平。本文公開了正鏈RNA病毒的增殖可通過使用雙鏈核糖核酸(dsRNA)來抑制，從而沉默對病毒增殖必需的人宿主細胞基因PIK4CB和/或PIK4CA的表達。本專利技術提供了多種實施方案，尤其包括:用于抑制細胞中磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)水平表達或活性的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列，且其中有義鏈包含第一序列和反義鏈包含第二序列，所述第二序 列包含基本互補于編碼PI4K的至少部分mRNA的互補區域，并且其中所述互補區域長度低于30個核苷酸和其中所述dsRNA與表達所述PI4K基因的細胞接觸后，抑制所述PI4K基因表達。這些dsRNA可具有化學修飾，且可與其它部分綴合。此夕卜，這些dsRNA可提供于藥物組合物中。一個實施方案方法是用于抑制細胞中磷脂酰肌醇4-激酶催化性β多肽(PIK4CB)基因或磷脂酰肌醇4-激酶催化性α多肽(PIK4CA)基因的方法，所述方法包括下列步驟:(a)向細胞中引入雙鏈核糖核酸(dsRNA),其中所述dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列，且其中有義鏈包含第一序列和反義鏈包含第二序列，所述第二序列包含基本互補于編碼PIK4CB或PIK4CA的至少部分mRNA的互補區域，并且其中所述互補區域長度低于30個核苷酸；和(b)將步驟(a)中產生的細胞維持足夠時間以獲得PIK4CB基因(或PIK4CA，根據選擇)的mRNA轉錄物的降解，從而抑制PIK4CB基因(或PIK4CA，根據選擇)在細胞中的表達或活性。備選地，本專利技術涉及治療由正鏈RNA病毒感染介導的病理學過程的方法，所述方法包括向需要此種治療的患者施用本專利技術的dsRNA。正鏈RNA病毒可選自丙型肝炎病毒(HCV本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于在細胞中抑制磷脂酰肌醇4?激酶表達的雙鏈核糖核酸，所述雙鏈核糖核酸的縮寫是dsRNA，其中第一鏈和第二鏈的序列是PIK4CB1的第一鏈和第二鏈的序列，分別由SEQ?ID?NO:210和314組成，并且其中所述dsRNA與表達所述磷脂酰肌醇4?激酶基因的細胞接觸后，抑制所述磷脂酰肌醇4?激酶基因的表達。

【技術特征摘要】
2007.07.05 US 60/948,100中使用的一些術語和短語的含義。如果術語在本說明書其它部分的用法與其在本部分提供的定義之間存在明顯差異，那么以本部分的定義為準。[0042]“ G ”、“ C ”、“ A ”和“ U ”各自通常分別代表含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作為堿基的核苷酸。然而，應當理解，術語“核糖核苷酸”或“核苷酸”也指如下文進一步詳述的經修飾的核苷酸、或者替代的置換部分。技術人員熟知，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以用其它部分進行置換而基本不會改變寡核苷酸的堿基配對特性，其中所述的寡核苷酸包含具有此種置換部分的核苷酸。例如，不作限制地，包含肌苷作為其堿基的核苷酸可以與含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸形成堿基對。因此，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸在本發明的核苷酸序列中可以用含有例如肌苷的核苷酸替換。包含此類置換部分的序列為本發明的實施方案。[0043]如本文所用，“靶序列”指在PIK4CB的轉錄期間形成的mRNA分子的核苷酸序列的連續部分，包括為初級轉錄產物的RNA加工產物的mRNA。[0044]如本文所用，術語“包含序列的鏈”指的是包含一連串核苷酸的寡核苷酸，其中所述的一連串核苷酸通過使用標準核苷酸命名法指代的序列進行描述。[0045]如本文所用，并且除非另外說明，否則術語“互補的”當用于相對于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列時，其指的是包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定條件下與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或者多核苷酸雜交、并形成雙鏈體結構的能力，這一點為技術人員所理解。此類條件可以是例如嚴格條件，其中所述的嚴格條件可以包括:400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、lmM EDTA50°C或 70°C 12-16 小時，然后洗滌。也可以應用其它條件，例如在生物體內可能遇到的生理相關條件。技術人員能夠根據雜交核苷酸的最終應用來確定最適合兩個序列互補性測試的條件設置。[0046]這包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在全長的第一和第二核苷酸序列上的堿基配對。在本文，此類序列可以稱為彼此“完全互補的”。然而，在本文，當其中第一序列稱為與第二序列“基本互補的”時，這兩個序列可以完全互補，或者它們于與其最終應用最相關的條件下保留雜交能力的同時，可以在雜交后形成一個或 多個，但通常不多于4個、3個或2個錯配堿基對。然而，在將兩條寡核苷酸設計為在雜交后形成一個或多個單鏈突出時，根據互補性的測定，此類突出并不視為錯配。例如，包含一條長21個核苷酸的寡核苷酸和另一長23個核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中較長的寡核苷酸包含與較短寡核苷酸完全互補的21個核苷酸的序列，對于本發明的目的，仍可以稱為“完全互補的”。[0047]如本文所用，“互補的”序列也可包括非Watson-Crick堿基對、和/或由非天然和經修飾的核苷酸形成的堿基對，或者完全由上述堿基對形成，只要所述序列實現其對雜交能力的上述需求。[0048]在本文，術語“互補的”、“完全互補的”和“基本互補的”可以用于dsRNA有義鏈和反義鏈之間、或者dsRNA反義鏈和靶序列之間的堿基配對，正如其在本文的用途所理解的。[0049]如本文所用，與信使RNA (mRNA)的“至少部分基本互補”的多核苷酸指的是與目的mRNA (例如PIK4CB的mRNA或PIK4CA的mRNA)的連續部分基本互補的多核苷酸。例如，如果寡核苷酸序列與編碼PIK4CB的mRNA的非間斷部分基本互補，那么寡核苷酸至少與部分PIK4CB mRNA互補。同樣地，如果寡核苷酸序列與編碼PIK4CA的mRNA的非間斷部分基本互補，那么寡核苷酸至少與部分PIK4CA mRNA互補。[0050]如本文所用，術語“雙鏈RNA”或“dsRNA”指的是具有包含兩條反向平行、并且基本互補(如上文定義)的核酸鏈的雙鏈體結構的核糖核酸分子復合體。形成雙鏈體結構的兩條鏈可以是一個較大RNA分子的不同部分，或者是分開的RNA分子。當為分開的RNA分子時，此類dsRNA在文獻中通常稱為siRNA( “短干擾RNA”)。當兩條鏈是一個較大分子的部分、并因此通過形成雙鏈體結構的一條鏈的3’末端和另一鏈的5’末端之間不間斷的一連串核苷酸連接，連接的RNA鏈稱為“發夾環”、“短發夾RNA”或“shRNA”。當兩條鏈不是通過形成雙鏈體結構的一條鏈的3’末端和另一鏈的5’末端之間不間斷的一連串核苷酸而共價連接時，連接結構稱為“接頭”。RNA鏈可以具有相同或不同數...

【專利技術屬性】
技術研發人員：M·A·拉博，L·A·該賽，J·博勞斯基，
申請(專利權)人：諾瓦提斯公司，
類型：發明
國別省市：