基于核酸酶和發夾DNA探針的等溫信號擴增的多重基因分型的檢測方法技術

本發明專利技術涉及一種基于核酸酶和發夾DNA探針的等溫信號擴增的多重基因分型的檢測方法。本發明專利技術所述的檢測方法是基于核酸酶和發夾DNA探針的等溫信號擴增，并利用免疫膠體金作為放大顯色系統，以及利用核酸納米金生物傳感器作為核酸量的檢測系統，從而實現多重基因分型的目的。與傳統的基于PCR技術的核酸分析方法相比，本發明專利技術所述的檢測方法不需要熱循環儀，反應速度快，靈敏度高，檢測成本低，而且操作簡單，既解決了以往檢測方法中需要大型儀器的缺陷，又能保證檢測的靈敏度。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，涉及一種基于核酸酶和發夾DNA探針的等溫信號擴增的多重基因分型的檢測方法。
技術介紹
據聯合國世界衛生組織統計，全球死亡患者中，三分之一是死于不合理用藥，而非死于自然疾病本身。在我國，每年的住院病人約有5000多萬，其中至少250萬與藥物不良反應有關，有約20萬人因此而死亡。個人基因不同，會導致機體對特定藥物的代謝能力不同，從而直接關系到藥物療效和毒副作用的強弱一一若藥物在體內代謝較慢，代謝產物不易排出體外，容易積聚而引起藥物性肝炎，嚴重者則引起藥物中毒；若藥物在體內代謝過快，就會導致常規劑量療效降低或者無效，延誤病情。生物醫學研究成果表明，人體對藥物處置及效應是存在個體差異的，絕大部分的藥物反應個體差異是由遺傳因素造成的。基因不同直接關系到藥物療效和毒副作用的強弱。因此，根據病人基因結構信息，尤其是發生變異的基因結構，有針對性地選擇藥物，并確定最適合病人的用藥劑量，將成為未來理想的治病新模式。基因導向個性化用藥的技術研究可以應用于對人體血液中藥物代謝基因型(藥物代謝酶、轉運體和受體基因)的·檢測，對藥物使用進行個性化評估，從而根據每個人基因的不同，使用不同的藥和藥量。細胞色素CYP2D6是重要藥物代謝酶，代謝的藥物占總CYP450代謝藥物的20 %。CYP2D6基因位于第22號染色體(22ql3.1),已經發現有78種等位基因。CYP2D6基因多態性使藥物代謝在不同種族之間，甚至在同種族不同人群中產生較大的差異，從而影響藥物的療效。快速分析CYP2D6基因的多態性，對指導臨床合理用藥和調整用藥方案具有重大意義。基于聚合酶鏈式反應(PCR)技術的分子診斷技術，如限制性內切酶酶切分型、引物特異性聚合酶鏈式擴增、實時定量PCR、測序技術，是目前廣泛使用的基因分型工具，它們的靈敏度可以達到幾個拷貝。然而這些技術需要復雜昂貴的熱循環儀和專業操作人員，無法滿足發展中國家以及缺乏先進醫療資源的邊遠地區的需求，更無法滿足現場快速診斷的要求。為了解決基于PCR技術的診斷方法都需要依賴熱循環儀這一問題，目前也專利技術出一些基于等溫核酸擴增的技術，例如核酸序列依賴性擴增技術(Nucleic-acid sequencebased amplification, NASBA)> 環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)、解旋酶依賴性DNA擴增技術(Helicase-dependent isothermal DNAamplification, HAD)等。等溫核酸擴增技術能夠在恒定溫度下擴增核酸，縮短了診斷時間、降低了對儀器設備的要求。然而，這些技術也涉及到一些急需解決的問題，如NASBA僅僅適用于RNA分析并且涉及多個酶反應步驟，LAMP需要復雜的引物設計而且無法依據產物大小分析擴增產物，HDA所需有的解旋酶容易受到樣本的抑制，這些問題都影響到了檢測方案的穩定性和應用的廣泛性，削弱了等溫擴增技術在分子診斷上的優勢。自21世紀以來，納米金層析技術在現場快速測定中的應用不斷擴大，它可以檢測多種分析物，而且簡單快速，因而對眾多行業產生了巨大影響。在實際的檢測中，通常僅僅需要一滴血液尿液或者唾液，即可得到準確的結果，進而立即展開治療。獸醫、食品儲藏及環境檢測也經常使用層析檢測，無需特別的儀器或者培訓
技術實現思路
本專利技術所述為一種基于核酸酶和發夾DNA探針的等溫信號擴增的多重基因分型的檢測方法。與傳統的基于PCR技術的核酸分析方法相比，本專利技術所述的檢測方法不需要熱循環儀，反應速度快，靈敏度高，檢測成本低，而且操作簡單，既解決了以往檢測方法中需要大型儀器的缺陷，又能保證檢測的靈敏度。本專利技術所述的基于核酸酶和發夾DNA探針的等溫信號擴增的多重基因分型的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:針對靶標DNA的多態性位點的兩種等位基因，配備用于在一次反應中同時分析兩種等位基因等溫信號擴增反應體系，該體系含有兩種發夾DNA探針和相應引物，它們分別對應于各自的靶標等位基因，反應體系為100 μ 1，包含:成分終濃度pH7.90 TVis-HcI5OmMNaCl200mMMgC 125 IiiMdNTPsΙΟΟμΜ 野生型基因發夾DNA探針 50 ηΜ 野生型基因引物50 ηΜ 突變型基因發夾DNA探針 50 ηΜ 突變型基因引物50 ηΜ Klenow fragment exo-聚合 _ 2.5 U Nt.BbvC I 切刻酶5 U靶標DNA樣本 I μ I 其余為水；反應條件為:37°C恒溫反應60分鐘；在所述的等溫信號擴增反應體系中，所述野生型基因發夾DNA探針包括:針對野生型靶標基因設計的識別序列，該識別序列由發夾DNA探針的環序列上游15bp和與此相連的5’端莖序列的8bp構成(5’端上游3bp序列為隨機序列5’ -TAC-3’)，總長度23bp ;在所述識別序列的下游插入一段Nt.BbvC I切刻酶識別序列5’ -GCTGAGG-3’ ；在切刻酶識別序列的下游是長12bp的莖序列，其中Ilbp與5’端形成莖狀結構，在序列最后加入一個任意堿基，以抑制引物與探針結合后聚合酶延長探針3’端；所述發夾DNA探針的5’端用生物素修飾。在所述的等溫信號擴增反應體系中，所述突變型基因發夾DNA探針包括:針對突變型靶標等位基因設計的識別序列，該識別序列由發夾DNA探針的環序列上游15bp和與此相連的5’端莖序列的8bp構成(5’端上游3bp序列為隨機序列5’ -TAC-3’)，總長度23bp ；在所述識別序列的下游插入一段Nt.BbvC I切刻酶識別序列5’ -GCTGAGG-3’ ；在切刻酶識別序列的下游是長12bp的莖序列，其中Ilbp與5’端形成莖狀結構，在序列最后加入一個任意堿基，以抑制引物與探針結合后聚合酶延長探針3’端；所述發夾DNA探針的5’端用生物素修飾。在所述的等溫信號擴增反應體系中，所述野生型基因引物由兩部分構成，下游8bp部分是所述野生型基因探針的3’端莖序列中的識別序列的互補序列，下游是IObp的標簽DNA 序列 5’ -GTTAGGTAGA-3’。在所述的等溫信號擴增反應體系中，所述突變型基因引物由兩部分構成，下游8bp部分是所述突變型基因探針的3’端莖序列中的識別序列的互補序列，下游是IObp的標簽DNA 序列 5’ -CTATTGC TTG-3’。將等溫擴增產物與膠體金-鏈酶親和素混合均勻，靜置5分鐘后，取混合液滴于核酸納米金生物傳感器的樣品墊進行檢測；所述的核酸納米金生物傳感器包括:從左至右固定于膠板上的樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙；硝酸纖維素膜上靠近樣品墊一端的地方固定有用于檢測野生型等位基因的寡核苷酸探針，形成野生型等位基因檢測線；在該野生型等位基因檢測線后，固定有用于檢測野生型等位基因的寡核苷酸探針，形成突變型等位基因檢測線；硝酸纖維素膜靠近吸水紙一端的地方固定有抗鏈酶親和素抗體，形成質控線。所述用于檢測野生型等位基因的寡核苷酸探針序列是所述野生型引物的標簽DNA的互補序列，在該序列的3’加入10個A堿基作為間臂以弱化空間位阻效應。所述用于檢測突變型等位基因的寡核苷酸探針序列是所述突變型引物的標簽DN本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于核酸酶和發夾DNA探針的等溫信號擴增的多重基因分型的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：針對靶標DNA的多態性位點的兩種等位基因，配備用于在一次反應中同時分析兩種等位基因等溫信號擴增反應體系，該體系含有兩種發夾DNA探針和相應引物，它們分別對應于各自的靶標等位基因，反應體系為100μl，包含：反應條件為：37℃恒溫反應60分鐘；在所述的等溫信號擴增反應體系中，所述野生型基因發夾DNA探針包括：針對野生型靶標基因設計的識別序列，該識別序列由發夾DNA探針的環序列 上游15bp和與此相連的5’端莖序列的8bp構成，總長度23bp，其中5’端上游3bp序列為隨機序列5’?TAC?3’；在所述識別序列的下游插入一段Nt.BbvCⅠ切刻酶識別序列5’?GCTGAGG?3’；在切刻酶識別序列的下游是長12bp的莖序列，其中11bp與5’端形成莖狀結構，在序列最后加入一個任意堿基，以抑制引物與探針結合后聚合酶延長探針3’端；所述發夾DNA探針的5’端用生物素修飾；在所述的等溫信號擴增反應體系中，所述突變型基因發夾DNA探針包括：針對突變型靶標等位基因設計的識別序列，該識別序列由發夾DNA探針的環序列上游15bp和與此相連的5’端莖序列的8bp構成，總長度23bp，其中5’端上游3bp序列為隨機序列5’?TAC?3’；在所述識別序列的下游插入一段Nt.BbvCⅠ切刻酶識別序列5’?GCTGAGG?3’；在切刻酶識別序列的下游是長12bp的莖序列，其中11bp與5’端形成莖狀結構，在序列最后加入一個任意堿基，以抑制引物與探針結合后聚合酶延長探針3’端；所述發夾DNA探針的5’端用生物素修飾；在所述的等溫信號擴增反應體系中，所述野生型基因引物由兩部分構成，下游8bp部分是所述野生型基因探針的3’端莖序列中的識別序列的互補序列，下游是10bp的標簽DNA序列5’?GTTAGGTAGA?3’；在所述的等溫信號擴增反應體系中，所述突變型基因引物由兩部分構成，下游8bp部分是所述突變型基因探針的3’端莖序列中的識別序列的互補序列，下游是10bp的標簽DNA序列5’?CTATTGCTTG?3’；將等溫擴增產物與膠體金?鏈酶親和素混合均勻，靜置5分鐘后，取混合液滴于核酸納米金生物傳感器的樣品墊進行檢測；所述的核酸納米金生物傳感器包括：從左至右固定于膠板上的樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙；硝酸纖維素膜上靠近樣品墊一端的地方固定有用于檢測 野生型等位基因的寡核苷酸探針，形成野生型等位基因檢測線；在該野生型等位基因檢測線后，固定有用于檢測野生型等位基因的寡核苷酸探針，形成突變型等位基因檢測線；硝酸纖維素膜靠近吸水紙一端的地方固定有抗鏈酶親和素抗體，形成質控線；所述用于檢測野生型等位基因的寡核苷酸探針序列是所述野生型引物的標簽DNA的互補序列，在該序列的3’加入10個A堿基作為間臂以弱化空間位阻效應；所述用于檢測突變型等位基因的寡核苷酸探針序列是所述突變型引物的標簽DNA的互補序列，在該序列的3’加入10個A堿基作為間臂以弱化空間位阻效應；結果判定標準是：如果質控線出現紅色，而兩條檢測線任意一條都未出現紅色，表明被檢樣品為陰性，說明核酸提取失敗或者擴增反應失敗；如果兩條檢測線或者其中一條和質控線同時出現紅色，表明被檢樣品為陽性；在這種情況下，如果檢測線T1出現紅色，表明被檢樣品為野生型純合子，如果檢測線T2出現紅色，表明被檢樣品為突變型純合子，如果兩條檢測線出現紅色，表明被檢樣品為雜合子；利用試紙條檢測儀器讀出檢測線和質控線的信號峰面積，對靶標DNA做定量分析。FDA00003105743200011.jpg...

【技術特征摘要】
1.一種基于核酸酶和發夾DNA探針的等溫信號擴增的多重基因分型的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 針對靶標DNA的多態性位點的兩種等位基因，配備用于在一次反應中同時分析兩種等位基因等溫信號擴增反應體系，該體系含有兩種發夾DNA探針和相應引物，它們分別對應于各自的靶標等位基因，反應體系為100 μ 1，包含:2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的核酸納米金生物傳感...

【專利技術屬性】
技術研發人員：曾令文，劉杰，陳凌波，
申請(專利權)人：中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院，
類型：發明
國別省市：