抗稻瘟病基因pi5的檢測方法技術

本發明專利技術屬于分子生物學領域，具體涉及抗稻瘟病基因pi5的檢測方法。本發明專利技術公開了一種抗稻瘟病基因pi5的顯性分子標記pi5-2-3，它是用引物對SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2從水稻總DNA中擴增出的核苷酸序列，可以應用于水稻稻瘟病抗性育種中pi5的分子標記輔助選擇，以提高抗病品種選育的效率，減少田間鑒定的工作量。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于分子生物學領域，具體涉及。
技術介紹
稻痕病(Pyriculariagrisea cav.)是由稻痕病菌(Magnaporthe oryzae ;無性態:Pyri cu I aria)引起的水稻病害,其分布范圍十分廣泛。據統計,全世界有80余個國家均有發生，一般流行年份可造成10 % -20 %的減產，嚴重發生時則達到40 % -50 %。20世紀90年代以來，我國稻瘟病的年發生面積均在380萬hm2以上，每年損失稻谷達數億千克。隨著品種應用的單一化、集中化以及氣候的影響，稻瘟病的危害也越來越重。盡管人們在病害防治上耗費了巨大的精力和物質投入，但限于諸多方面因素的影響，防病效果一直不盡人意，尤其在病害嚴重發生年份，常常給生產、育種造成重大損失。以遼寧省為例，自20世紀90年代起，分別發生了因遼粳287、遼鹽241、遼粳454和遼星I號幾個主栽品種抗病性退化導致的穗頸瘟大面積發生，嚴重影響了北方粳稻的生產。產生這種現象的根本原因就是主栽品種對稻瘟病菌的抗譜狹窄，且單一化、集中化種植現象普遍，這樣一旦稻瘟菌流行小種發生變化，品種對稻瘟病的抗性便迅速下降。因此，選育聚合多基因或具廣譜抗性的水稻品種尤為必要。目前，在抗稻瘟病品種選育的過程中，育種家主要采用系譜法，或結合分子標記輔助選擇抗病個體。傳統的系譜法通過兩親本組配，從分離后代中擇優選育品種，抗瘟表型依賴于田間自然鑒定或人工接種鑒定，鑒別難度大，準確率低。由于不了解親本的抗瘟基因型，育種者在親本選擇上非常盲目，通常是海量配組，海量選擇后代，工作量大，育種效率低。在利用分子標記輔助選擇進行抗病育種時，所選用的多是與抗病基因連鎖的SSR標記，易造成假陽性的判斷，如能根據抗感等位基因本身的序列差異來設計不同基因的共分離標記，不僅可首先檢測親本所攜帶的抗瘟基因，也能在后代輔助選擇時大大提高抗性品種選擇的準確性。 水稻抗稻痕病基因Pi5 (Jeon J S, et al.Genetic and physical mappingof Pi5 (t), a locus associated with broad-spectrum resistance to rice blast.Molecular Genetics and Genomics,2003,269(2):280-289 ；ffang G L, et al..RFLPMapping of Genes Conferring Complete and Partial Resistance to Blast in aDurably Resistant Rice Cultivar Genetics, 1994,136 (4): 1421-1434)位于水稻第 9 染色體上S04G03和C1454之間的170kb區間內，包含兩個獨立遺傳的NBS-LRR類基因(Pi5_l和Pi5-2)，且兩個基因的蛋白產物在氨基端都有CC結構。Pi5-1和Pi5-2分別有5和6個外顯子，蛋白產物分別含有1025和1063個氨基酸；基因表達分析表明Pi5-1受病原菌誘導表達，而Pi5-2是組成性表達，在溫室人工接種條件下對P06-6等5個稻瘟病小種表現完全抗性，Pi5基因原始抗性供體為RIL260 (Wang G L, et al..RFLP Mapping of GenesConferring Complete and Partial Resistance to Blast in a Durably Resistant RiceCultivar Genetics,1994,136(4):1421-1434)。
技術實現思路
為了高效選擇抗稻瘟病水稻品種，有針對性的、特異性的選擇含Pi5基因的后代材料，本專利技術提供一種用于檢測水稻抗稻瘟病基因Pi5的分子標記pi5-2-3，分子標記與Pi5基因共分離，可以用于Pi5基因的輔助選擇，以提高分子標記輔助選擇的效率及抗病品種選育的效率。本專利技術提供如下解決方案:一種與水稻抗稻瘟病基因pi5連鎖的分子標記pi5-2_3，如SEQ ID NO:3所示，所述分子標記pi5-2-3與水稻抗稻痕病基因pi5共分尚。一種用于檢測分子標記pi5-2-3是否存在的引物對DNA，如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2 所示。一種檢測水稻DNA中是否存在水稻抗稻瘟病基因pi5的方法，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列為引物，擴增待檢測DNA，且擴增子含有如SEQ ID NO:3 (960bp)所示序列即為含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。一種抗稻瘟病水稻品種分子標記輔助選擇方法，以含有抗稻瘟病基因pi5的水稻材料為親本，與其他水稻品種雜交，提取雜交后代個體基因組DNA，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示序列為引物進行PCR擴增，且擴增子含有如SEQ ID NO:3所示序列的對應個體即含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。上述引物對優選對水稻苗期所提取的DNA進行標記鑒定，檢測是否攜帶抗稻瘟病基因Pi5，由于上述引物對是基于基因組CDS序列的差異設計的，因此檢測方便，準確率高，該分子標記可以作為水稻稻瘟病抗病育種中Pi5基因分子標記輔助選擇的應用。附圖說明 圖1是分子標記pi5-2_3在抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260、pi5單基因系和5個高感水稻品種中擴增產物的凝膠電泳圖；其中，M:2000bp分子量標記(TIANGEN MD114-02)，200ng ;片段長度分別為:lOObp,250bp，500bp，750bp，lOOObp,2000bp。I:RIL260 ；2:麗江新團黑谷；3:遼鹽241 ；4:鹽豐47 ；5:日本晴；6:遼星I號；7:pi5單基因系其中抗病基因供體品種RIL260、pi5單基因系擴增產物片段大小為960bp，而感病品種無擴增產物。圖2是分子標記pi5-2-3在抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260、pi5單基因系(從IRRI引進)及9個水稻品種中擴增產物的凝膠電泳圖。其中，M:2000bp分子量標記(TIANGEN MD114-02)，200ng ;片段長度分別為:IOObp,250bp,500bp,750bp,lOOObp,2000bp。I:RIL260 ；2:麗江新團黑谷；3:遼粳454 ；4:遼粳371 ；5:沈農265 ；6:遼農979 ；7:沈稻7 ；8:越光；9:pi5單基因系；10:港源8號；11:遼鹽241。其中6號品種擴增產物片段長度和pi5單基因系及供體品種RIL260 —致，進一步測序結果表明其擴增產物序列與SEQ ID NO:3所述序列一致，確定攜帶抗稻瘟病基因pi5，而其余品種均無PCR擴增產物，說明不含有抗稻瘟病基因pi5。具體實施例方式實施例1:DNA提取、PCR擴增和電泳分析一、DNA 提取(CTAB 法):稱取0.1 0.2g水稻葉片并剪成Icm長，在液氮中研磨，待液氮蒸發完后(注意:勿使樣品融化)，迅速轉入含65°C預熱過的提取液(1M Tris pH8.0, IOOmM ；5M NaCl, 1.0M ；0.5M EDTA, 20mM ；10% CTAB, 2.0% )400 μ L 的離心管中。輕本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測水稻DNA中是否存在水稻抗稻瘟病基因pi5的方法，以SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示序列為引物，擴增待檢測DNA，且擴增子含有如SEQ?ID?NO：3所示序列即為含有水稻抗稻瘟病基因pi5。

【技術特征摘要】
1.一種檢測水稻DNA中是否存在水稻抗稻瘟病基因pi5的方法，以SEQ ID NO :1和SEQID NO :2所示序列為引物，擴增待檢測DNA，且擴增子含有如SEQ ID NO :3所示序列即為含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。2.一種抗稻瘟病水稻品種分子標記輔助選...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張麗霞，王妍，陸曉春，鄭文靜，趙家銘，
申請(專利權)人：遼寧省農業科學院，鄭文靜，陸曉春，
類型：發明
國別省市：