用于從重組大腸桿菌純化人粒細胞集落刺激因子的方法技術

本發明專利技術提供了一種用于以高產率和純度從重組大腸桿菌純化大量人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法。根據本發明專利技術的方法，可以容易地以高產率和純度純化與在人體中表達的天然形式相同的人粒細胞集落刺激因子而無需其他活化過程。特別地，根據本發明專利技術的純化方法，高效地除去在大腸桿菌中表達的hG-CSF變體以得到具有高純度的生理活性hG-CSF。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用于從重組大腸桿菌純化人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法。更具體地，本專利技術涉及用于以高純度和產率從重組大腸桿菌純化人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法，其包括以下步驟:(a)培養表達hG-CSF的重組大腸桿菌以通過離心得到細胞沉淀；(b)將含hG-CSF的上清液與步驟(a)中得到的細胞沉淀分離；(c)用酸處理步驟(b)中得到的上清液以通過過濾分離所得沉淀；(d)將步驟(C)中得到的濾出液用于陽離子交換色譜；(e)將步驟(d)中得到的洗脫液用于疏水相互作用色譜；以及(f)將步驟(e)中得到的洗脫液用于陰離子交換色譜。
技術介紹
集落刺激因子(CSF)由T細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞產生，并且這些細胞廣泛分布于機體中。已知的CSF包括GM-CSF、M-CSF和G-CSF。其中，GM-CSF是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，并且作用于粒細胞或巨噬細胞的干細胞以誘導它們的增殖和分化，從而刺激粒細胞或巨噬細胞的集落形成。M-CSF (巨噬細胞-CSF)是巨噬細胞集落刺激因子，并用主要行使刺激巨噬細胞集落形成的功能。G-CSF (粒細胞-CSF)是粒細胞集落刺激因子，并且刺激粒細胞的集落形成和誘導最終分化。通常而言，為了分離和純化G-CSF，培養細胞并從培養上清液中分離G-CSF蛋白。但是，該方法存在G-CSF產率低的問題，并且因此不適于大量生產。另外，ChugaiPharmaceuticals C0.,Ltd.(日本)開發了一種通過使用包含編碼hG_CSF之多核苷酸的基因組DNA或cDNA在哺乳動物細胞中產生糖基化hG-CSF的方法(韓國專利N0.47178,53723和57582)。但是，已知糖基化hG-CSF的糖鏈對于hG-CSF的活性而言不是必需的，并且使用哺乳動物細胞產生糖基化hG-CSF需要`昂貴的材料和設備，因此，這樣的方法在經濟上不可行。進行了許多嘗試來通過使用原核細胞產生非糖基化hG-CSF。在這些研究中，產生了因ATG起始密碼子而在其N末端連接有甲硫氨酸殘基的hG-CSF，但該形式與其天然形式不同。此外，在微生物中產生的hG-CSF可以被來自宿主細胞或培養材料的雜質污染，并且就應用于高純度藥物而言，需要復雜的純化過程。此外，當使用大腸桿菌作為宿主細胞時，大多數hG-CSF作為不溶性包涵體沉積在細胞中，而且必須使它們通過重折疊過程轉化為活性形式，產率顯著損失。在該過程中，誘導了部分還原、分子內二硫鍵形成或錯誤二硫鍵形成，因此需要繁瑣的過程來將它們除去并且引起了效力的損失。一個半胱氨酸殘基不參與形成二硫鍵，并且因此以游離形式存在，導致額外的效力損失和蛋白質溶液穩定性的下降。因此，需要開發一種用于大量產生在其N-末端沒有甲硫氨酸殘基并因此即使使用微生物也與天然形式相同的hG-CSF的方法。為了解決這些問題，本專利技術人在之前已報道，通過修飾大腸桿菌耐熱腸毒素II的已知信號肽制備了具有高表達率的新的分泌信號肽(韓國專利N0.316347)，并且用于產生天然hG-CSF。此外，本專利技術人已制備了包含重組基因的表達載體，通過連接hG-CSF基因(而非腸毒素基因)靠近大腸桿菌耐熱腸毒素II的經修飾信號肽制備，并且他們已使用該表達載體轉化了腸桿菌，從而通過使用微生物分泌系統在周質中表達生物活性hG-CSF(韓國專利 N0.356140)。通過使用將蛋白質分泌入周質的微生物系統，可以得到可溶形式的在N-末端沒有甲硫氨酸殘基的天然hG-CSF。此外，周質蛋白質通常小于總細胞蛋白質的10%，因此，與位于細胞質中的蛋白質相比，需要不那么大量的重組蛋白純化。此外，無需細胞破碎步驟，并且可以使存在于細胞質中的糖類和核酸污染最小化。但是，因為周質產生中的低表達水平，其難以工業化。因此，迫切需要開發用于以高產率和純度純化表達蛋白的高效方法。
技術實現思路
技術問題因此，本專利技術人努力解決了現有技術的這些問題。結果他們發現可以通過以下來以高純度大量產生天然人粒細胞集落刺激因子:培養重組大腸桿菌以得到分泌蛋白質，然后以下列順序將蛋白質用于酸沉淀一陽離子交換色譜一疏水相互作用色譜一陰離子交換色譜，從而完成本專利技術。問題的解決方案本專利技術的一個目的是提供用于以高純度和產率從重組大腸桿菌純化人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法，其包括以下步驟:(a)培養表達hG-CSF的重組大腸桿菌以通過離心得到細胞沉淀；(b)將含hG-CSF的上清液與步驟(a)中得到的細胞沉淀分離；(c)用酸處理步驟(b)中得到的上清液以通過過濾分離所得沉淀；(d)將步驟(C)中得到的濾出液用于陽離子交換色譜；(e)將步驟(d)中得到的洗脫液用于疏水相互作用色譜；以及(f)將步驟(e)中得到的洗脫液用于陰離子交換色譜。本專利技術的另一目的是提供通過上述方法從重組大腸桿菌分離和純化的具有高純度的生理活性無變體hG-CSF。本專利技術的有利作用根據本專利技術的方法，可以容易地以高產率和純度純化與在人體中表達的天然形式相同的人粒細胞集落刺激因子而無需其他活化過程。具體地，根據本專利技術的方法，高效地除去在大腸桿菌中表達的hG-CSF變體以得到具有高純度的生理活性hG-CSF。附圖簡述附圖說明圖1示出了得自根據本專利技術的純化方法從重組大腸桿菌的周質純化的hG-CSF的滲透提取(osmotic extraction)、酸沉淀、陽離子交換色譜和疏水相互作用色譜步驟之各溶液的SDS-PAGE結果，其中泳道1:標準品泳道2: 步驟(b)首次離心的上清液泳道3:步驟(b) 二次離心的上清液泳道4:通過步驟(C)的酸沉淀得到的上清液泳道5:通過步驟(C)的過濾得到的濾出液泳道6:步驟⑷的SP-瓊脂糖柱的柱流泳道7:步驟(d)的SP-瓊脂糖柱的柱洗脫液I流泳道8:步驟⑷的SP-瓊脂糖柱的柱洗脫液2流泳道9:步驟(e)的丁基-瓊脂糖柱的柱流2流泳道10:步驟(e)的丁基-瓊脂糖柱的柱洗脫液2流；圖2示出通過本專利技術純化方法的陰離子交換色譜得到的柱洗脫液的SDS-PAGE結果O圖3示出通過本專利技術純化方法的陰離子交換色譜得到的柱洗脫液的反相高壓色並奸里5口術。圖4示出通過本專利技術純化方法的陰離子交換色譜得到的柱洗脫液的大小排阻高壓色譜結果。用于實施本專利技術的最佳方式本專利技術提供了用于以高純度簡單地從重組大腸桿菌純化大量人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)而無需其他活化過程的方法。具體地，根據本專利技術的純化方法可包括以下步驟:(a)培養表達hG-CSF的重組大腸桿菌以通過離心得到細胞沉淀；(b)將含hG-CSF的上清液與步驟(a)中得到的細胞沉淀分離；(c)用酸處理步驟(b)中得到的上清液以通過過濾分離所得沉淀；(d)將步驟(C)中得到的濾出液用于陽離子交換色譜；(e)將步驟(d)中得到的洗脫液用于疏水相互作用色譜；以及(f)將步驟(e)中得到的洗脫液用于陰離子交換色譜。根據本專利技術的純化方法，其特征在于在酸沉淀之后，將得自重組大腸桿菌的hG-CSF用于一系列色譜步驟(陽離子交換色譜、疏水相互作用色譜和陰離子交換色譜)，從而分離適于藥用的高純度hG-CSF。在下文中，將對根據本專利技術的純化方法的各步驟進行詳細描述。步驟(a)是培養表達hG-CSF的重組大腸桿菌以通過離心獲得細胞沉淀的步驟。用本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：崔圣喆，金鎮基，吳映學，李鐘守，
申請(專利權)人：韓美科學株式會社，
類型：
國別省市：