一種重組雞大腸桿菌外膜蛋白包涵體的純化及高效復性液對其復性的方法技術

本發明專利技術屬于蛋白純化的技術領域，涉及的是生物醫藥及生物工程下游蛋白純化領域，本發明專利技術公開了一種重組雞大腸桿菌外膜蛋白包涵體的純化及高效復性液對其復性的方法。本發明專利技術的包涵體蛋白的三步洗滌純化工藝方法，使菌體蛋白與包涵體得到很好的分離，再通過復性溶液及點滴加樣一次復性的工藝方法，使蛋白質的復性率大大提高，同時簡化復性工藝及所需設備，從而大大提高目的蛋白的收獲率，降低重組雞大腸桿菌外膜蛋白的生產成本。該重組雞大腸桿菌外膜蛋白純化方法簡便易行，無需進行過柱處理。

【技術實現步驟摘要】

【技術保護點】
一種重組雞大腸桿菌外膜蛋白包涵體的純化及高效復性液對其復性的方法，其特征在于包括以下步驟：(1)包涵體蛋白的提取：4℃，4000～6000rpm，10～20min，離心收集菌體，PBS洗滌菌體，4℃，6000～8000rpm，10～20min，將菌體超聲破碎，功率400瓦，超聲5秒,間歇25秒，工作時間20～35分鐘，所述菌體為重組雞大腸桿菌；然后4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷凍離心得到雞大腸桿菌外膜蛋白包涵體蛋白質；(2)包涵體蛋白質的純化：首先按質量體積比1：10～1：30將包涵體重懸于第一洗滌液中，所述洗滌液為：NaCl?137mmol/L，KCl?2.7mmol/L，Na2HPO4?10mmol/L，KH2PO4?2mmol/L，0.2％～1.4％的tritonX?100，pH?8.0～8.5；4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷凍離心；然后按質量體積比1：10～1：30將包涵體重懸于第二洗滌液種，所述第二洗滌液為：1～3mol/L尿素；4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷凍離心；接著按質量體積比1：20～1：50將包涵體重懸于第三洗滌液中，所述第三洗滌液為：0.6～2mol/L?NaCl，4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷凍離心；最后按質量體積比1：30～1：50將包涵體重懸于0.5～2％十二烷基硫酸鈉，4℃，8000～10000rpm，20～30min高速冷凍離心，收集沉淀；(3)包涵體蛋白質的溶解與復性，按質量體積比為1：10～1：40將步驟(2)得到的沉淀用變性劑重懸，所述變性劑為：5～7mol/L鹽酸胍，1～2mmol/L?EDTA，20～50mmol/L?Tris?Base，6～10mmol/L二硫蘇糖醇，pH?8.0～8.5；室溫放置至沉淀逐漸溶解；4℃，8000～10000rpm，10～20min高速冷凍離心，收集上清液；4℃條件下，使變性液逐滴加入復性緩沖液中，所述復性緩沖液為：0.2～0.8mol/L精氨酸，0.5～2mmol/L?EDTA，0.3～0.9mmol/L氧化型谷胱甘肽，60～100mmol/L?Tris?Base，15～30％甘油，pH?8.0～8.5，同時攪拌24～48h。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王連民，劉珂飛，孫珊珊，
申請(專利權)人：天津生機集團股份有限公司，
類型：發明
國別省市：天津;12