一種UPLC測定穿心蓮藥材指紋圖譜及四種二萜內(nèi)酯的方法技術

本發(fā)明專利技術涉及一種超高效液相色譜法測定穿心蓮藥材指紋圖譜和穿心蓮四種二萜內(nèi)酯的含量測定方法。制備穿心蓮藥材供試品溶液，將供試品注入超高效液相色譜儀，在本發(fā)明專利技術特定的色譜條件下采用梯度洗脫，得到穿心蓮藥材指紋圖譜和穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯的含量。綜合其指紋圖譜和四種二萜內(nèi)酯類成分含量測定數(shù)據(jù)，為判斷穿心蓮藥材真?zhèn)巍⒈ＷC穿心蓮藥材的內(nèi)在質(zhì)量、考察穩(wěn)定性和一致性提供依據(jù)，并且在保證穿心蓮藥材臨床的合理應用具有重要意義。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及一種穿心蓮藥材的超高效液相指紋圖譜及四種二萜內(nèi)酯的檢測方法，屬于藥物分析

技術介紹
穿心蓮Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees.為爵床科(Acanthaceae)穿心蓮屬AndrographisWall.exNees.植物，又名一見喜、苦草、四方草、印度草等，主產(chǎn)于廣東、福建等地，干燥地上部分作為藥用。《中國藥典》2010年版一部記載其性寒、味苦，具有清熱解毒、涼血、消腫之功效，被廣泛用于治療細菌性痢疾、急性扁桃體炎、尿路感染、流行性感冒和毒蛇咬傷等癥。由于中藥化學成分復雜，作用機制不明確，致使現(xiàn)有中藥制藥技術難以確保中藥產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性，中藥指紋圖譜建立的可以全面反映中藥內(nèi)在化學成分的種類與數(shù)量，進而反映中藥的質(zhì)量。現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確，采用中藥指紋圖譜的方式，將有效地表征中藥質(zhì)量。指紋圖譜已為國際社會所認可，有利于中藥及產(chǎn)品進入國際市場。穿心蓮藥材的真?zhèn)巍?nèi)在質(zhì)量對于后期制劑的工藝規(guī)范化控制和臨床用藥的有效性、安全性和穩(wěn)定性都具有非常重要的意義，所以尋找到一種比較好的穿心蓮藥材的鑒別和穿心蓮提取物含量的測定方法是極其具有價值的，而且采取多成分指標同時測定，也是保證藥材質(zhì)量和確切療效行之有效的方法。首先，本專利技術從鑒別穿心蓮藥材的方法入手，利用超高效液相色譜法(UPLC)建立穿心蓮藥材的指紋圖譜；并且同時測定了穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯四個穿心蓮主要二萜內(nèi)酯類成分的含量。本專利技術通過對超高效液相色譜法的提取溶劑、提取時間、提取方式、色譜柱、流動相、梯度洗脫程序以及檢測波長等色譜條件進行多方面考察，找到了一種更加準確、快速、靈敏度高、重復性好的鑒定穿心蓮藥材以及有效成分含量測定的方法。目前，現(xiàn)有技術中有對穿心蓮提取物進行指紋圖譜研究的報道，但采用4種參比物，最終只鑒定出7個共有峰，操作相對復雜，而精密度較差。本專利技術人有針對性的對這些缺點進行了研究，建立了一種新的標準指紋圖譜，利用該圖譜對穿心蓮藥材進行質(zhì)量監(jiān)督，以確保產(chǎn)品質(zhì)量。采用本專利技術的方法，提取時間短，不需減壓干燥，可防止有效成分變性。且色譜峰形和分離度得到了極大的改善。與現(xiàn)有文獻選擇了7個指紋峰比較，本專利技術中選取了更多的指紋峰，使得藥材質(zhì)量控制的準確性得到了很大的提高。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術提供一種穿心蓮超高效液相標準對照指紋圖譜，其建立方法如下：1)供試品溶液制備：取穿心蓮，采用甲醇水溶液進行提取，再加入甲醇水溶液調(diào)整溶液濃度，濾過，取濾液，既得；2)獲得色譜圖：配制穿心蓮內(nèi)酯溶液作為參照物，將供試品溶液和穿心蓮內(nèi)酯溶液注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖；3)生成對照指紋圖譜選擇合格的多批穿心蓮樣品的指紋圖譜，以穿心蓮內(nèi)酯峰為參比峰，得到27個共有峰的圖譜，用軟件，例如“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)3.0”(文獻：張宇，孫國祥，焦寶明等。冠心蘇合丸高效液相色譜數(shù)字化定量指紋圖譜研究[J].中南藥學，2013,11(1).)，按平均值法計算生成標準對照指紋圖譜。其中，色譜條件如下：采用AcquityUPLCBEHC18色譜柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脫；流動相A為0.2％-0.4％甲酸-水溶液，流動相B為甲醇：乙腈＝1：9～2：8混合溶液；進樣量為1-3μL；色譜柱溫度20℃-30℃；以穿心蓮內(nèi)酯為參照物，檢測波長為247-251nm；其中梯度洗脫程序如下所示：0～2min，88％～82％→80％～74％B；2～3min，80％～74％B；3～5min，80％～74％→79％～73％B；5～7min，79％～73％→78％～72％B；7～7.5min，78％～72％→72％～66％B；7.5～8min，72％～66％B；8～9min，72％～66％→68％～62％B；9～11min，68％～62％→63％～57％B；11～12min，63％～57％→61％～55％B；12～13min，61％～55％B；13～15min，61％～55％→38％～32％B；15～17min，38％～32％→23％～17％B；17～19min，23％～17％→88％～82％B；19～21min，88％～82％B。優(yōu)選的本專利技術所述的標準對照指紋圖譜，其建立方法如下：1)供試品溶液的制備，方法如下：精密稱定穿心蓮藥材粉末，加入20-200倍量(重量體積比)60-80％甲醇-水溶液超聲提取20-60min，超聲后，放置至室溫，用60-80％甲醇-水溶液據(jù)體積定容，0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得；2)以穿心蓮內(nèi)酯作為參照物制備標準對照品溶液，方法如下：精密稱取穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，加60-80％甲醇-水溶解制成0.5～1.5mg/ml的溶液，即得；3)標準對照指紋圖譜的確定，方法如下：將供試品溶液和對照品溶液注入高效液相色譜儀，得到色譜圖，多批穿心蓮樣品的指紋圖譜中共有27個峰為共有峰，計算27個共有指紋峰的相對保留時間和相對保留時間的RSD值，將積分信號導入“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)3.0”軟件，按平均值法計算生成標準對照指紋圖譜，其中，與穿心蓮內(nèi)酯對照品峰保留時間相同的色譜峰為17號峰；其中，色譜條件如下：采用AcquityUPLCBEHC18色譜柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脫；流動相A為0.3％甲酸-水溶液，流動相B為甲醇：乙腈＝1：9的混合溶液；進樣量為2μL；色譜柱溫度25℃；以穿心蓮內(nèi)酯為參照物，檢測波長為249nm；其中梯度洗脫程序如下所示：0～2min，85％→77％B；2～3min，77％B；3～5min，77％→76％B；5～7min，76％→75％B；7～7.5min，75％→69％B；7.5～8min，69％B；8～9min，69％→65％B；9～11min，65％→60％B；11～12min，60％→58％B；12～13min，58％B；13～15min，58％→35％B；15～17min，35％→20％B；17～19min，20％→85％B；19～21min，85％B。最優(yōu)選的，本專利技術所述的標準對照指紋圖譜，其建立方法如下：其中步驟1)供試品溶液的制備，方法如下：精密稱定穿心蓮藥材粉末，加入重量體積比為50倍量的80％甲醇-水溶液超聲提取20min，超聲后，放置至室溫，用80％甲醇-水溶液據(jù)體積定容，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。2)以穿心蓮內(nèi)酯作為參照物制備標準對照品溶液，方法如下：精密稱取穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，加80％甲醇-水溶解制成1mg/ml的溶液，即得。本專利技術還提供一種穿心蓮的超高效液相色譜指紋圖譜檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：1)待測樣品色譜圖的制備：取穿心蓮，采用甲醇水溶液進行提取，再加入甲醇水溶液調(diào)整溶液濃度，濾過，取濾液，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖；2)待本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種穿心蓮超高效液相標準對照指紋圖譜，其建立方法如下：1)供試品溶液制備：取穿心蓮，采用甲醇水溶液進行提取，再加入甲醇水溶液調(diào)整溶液濃度，濾過，取濾液，既得；2)獲得色譜圖：配制穿心蓮內(nèi)酯溶液作為參照物，將供試品溶液和穿心蓮內(nèi)酯溶液注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖；3)生成對照指紋圖譜：選擇合格的多批穿心蓮樣品的指紋圖譜，以穿心蓮內(nèi)酯峰為參比峰，得到27個共有峰的圖譜，按平均值法計算生成標準對照指紋圖譜；其中色譜條件如下：采用Acquity?UPLC?BEH?C18色譜柱(1.7μm，2.1×100mm)；梯度洗脫；流動相A為0.2％?0.4％甲酸水溶液，流動相B為甲醇：乙腈＝1：9～2：8混合溶液；進樣量為1?3μL；色譜柱溫度20℃?30℃；以穿心蓮內(nèi)酯為參照物，檢測波長為247?251nm；其中梯度洗脫程序如下：0～2min，88％～82％→80％～74％B；2～3min，80％～74％B；3～5min，80％～74％→79％～73％B；5～7min，79％～73％→78％～72％B；7～7.5min，78％～72％→72％～66％B；7.5～8min，72％～66％B；8～9min，72％～66％→68％～62％B；9～11min，68％～62％→63％～57％B；11～12min，63％～57％→61％～55％B；12～13min，61％～55％B；13～15min，61％～55％→38％～32％B；15～17min，38％～32％→23％～17％B；17～19min，23％～17％→88％～82％B；19～21min，88％～82％B。...

【技術特征摘要】
1.一種穿心蓮超高效液相標準對照指紋圖譜，其建立方法如下：
1)供試品溶液制備：
取穿心蓮，采用甲醇水溶液進行提取，再加入甲醇水溶液調(diào)整溶液濃度，濾
過，取濾液，既得；
2)獲得色譜圖：
配制穿心蓮內(nèi)酯溶液作為參照物，將供試品溶液和穿心蓮內(nèi)酯溶液注入超高
效液相色譜儀，得到色譜圖；
3)生成對照指紋圖譜：
選擇合格的多批穿心蓮樣品的指紋圖譜，以穿心蓮內(nèi)酯峰為參比峰，得到
27個共有峰的圖譜，按平均值法計算生成標準對照指紋圖譜；
其中色譜條件如下：采用AcquityUPLCBEHC18色譜柱(1.7μm，
2.1×100mm)；梯度洗脫；流動相A為0.2％-0.4％甲酸水溶液，流動相B為甲醇：
乙腈＝1：9～2：8混合溶液；進樣量為1-3μL；色譜柱溫度20℃-30℃；以穿心蓮
內(nèi)酯為參照物，檢測波長為247-251nm；其中梯度洗脫程序如下：0～2min，
88％～82％→80％～74％B；2～3min，80％～74％B；3～5min，80％～74％→79％～73％B；
5～7min，79％～73％→78％～72％B；7～7.5min，78％～72％→72％～66％B；7.5～8min，
72％～66％B；8～9min，72％～66％→68％～62％B；9～11min，68％～62％→63％～57％B；
11～12min，63％～57％→61％～55％B；12～13min，61％～55％B；13～15min，
61％～55％→38％～32％B；15～17min，38％～32％→23％～17％B；17～19min，
23％～17％→88％～82％B；19～21min，88％～82％B。
2.根據(jù)權利要求1所述的標準對照指紋圖譜，其建立方法如下：
1)供試品溶液的制備，方法如下：
精密稱定穿心蓮藥材粉末，加入重量體積比為20-200倍量的60％～80％甲醇
-水溶液超聲提取20-60min，超聲后，放置至室溫，用60％～80％甲醇-水溶液據(jù)
體積定容，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得；
2)獲得色譜圖，方法如下：
精密稱取穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，加60％～80％甲醇-水溶解制成
0.5～1.5mg/ml的溶液，即得，將供試品溶液和對照品溶液注入超高效液相色譜儀，
得到色譜圖；
3)生成對照指紋圖譜，方法如下：
將多批穿心蓮樣品的指紋圖譜中27個共有峰，按平均值法計算生成標準對
照指紋圖譜，其中，與穿心蓮內(nèi)酯對照品峰保留時間相同的色譜峰為17號峰；
其中，色譜條件如下：采用AcquityUPLCBEHC18色譜柱(1.7μm，
2.1×100mm)；梯度洗脫；流動相A為0.3％甲酸水溶液，流動相B甲醇：乙腈
＝1：9；進樣量為2μL；色譜柱溫度25℃；以穿心蓮內(nèi)酯為參照物，檢測波長為
249nm；其中梯度洗脫程序如下：0～2min，85％→77％B；2～3min，77％B；3～5min，
77％→76％B；5～7min，76％→75％B；7～7.5min，75％→69％B；7.5～8min，69％B；
8～9min，69％→65％B；9～11min，65％→60％B；11～12min，60％→58％B；12～13min，
58％B；13～15min，58％→35％B；15～17min，35％→20％B；17～19min，20％→
85％B；19～21min，85％B。
3.根據(jù)權利要求2所述的標準對照指紋圖譜，其建立方法如下：
其中，
步驟1)供試品溶液的制備，方法如下：
精密稱定穿心蓮藥材粉末，加入重量體積比為50倍量的80％甲醇-水溶液超
聲提取20min，超聲后，放置至室溫，用80％甲醇-水溶液據(jù)體積定容，用0.22μm
微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得；
步驟2)獲得色譜圖，方法如下：
精密稱取穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，加80％甲醇-水溶解制成1mg/ml的溶液，
即得，將供試品溶液和對照品溶液注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖。
4.一種穿心蓮超高效液相色譜指紋圖譜檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：
1)待測樣品色譜圖的制備：
取穿心蓮，采用甲醇水溶液進行提取，再加入甲醇水溶液調(diào)整溶液濃度，濾
過，取濾液，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖；
2)待測樣品色譜圖和標準對照指紋圖譜相似度計算：
將待測樣品的色譜圖按平均值法進行計算，比較待測樣品的色譜圖和標準對

\t照指紋圖譜相似度；
色譜條件如下：采用AcquityUPLCBEHC18色譜柱(1.7μm，2.1×100mm)；
梯度洗脫；流動相A為0.2％-0.4％甲酸水溶液，流動相B為甲醇：乙腈＝1：9～2：
8混合溶液；進樣量為1-3μL；色譜柱溫度20℃-30℃；以穿心蓮內(nèi)酯為參照物，
檢測波長為247-251nm；其中梯度洗脫程序如下：0～2min，
88％～82％→80％～74％B；2～3min，80％～74％B；3～5min，80％～74％→79％～73％B；
5～7min，79％～73％→78％～72％B；7～7.5min，78％～72％→72％～66％B；7.5～8min，
72％～66％B；8～9min，72％～66％→68％～62％B；9～11min，68％～62％→63％～57％B；
11～12min，63％～57％→61％～55％B；12～13min，61％～55％B；13～15min，
61％～55％→38％～32％B；15～17min，38％～32％→23％～17％B；17～19min，
23％～17％→88％～82％B；19～21min，88％～82％B。
5.根據(jù)權利要求4的指紋圖譜檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：
1)待測樣品色譜圖的制備：
精密稱定穿心蓮藥材粉末，加入重量體積比為20-200倍量60-80％甲醇-水溶
液超聲提取10-60min，超聲后，放置至室溫，用60-80％甲醇-水溶液據(jù)體積定容，
微孔濾膜濾過，...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：佟玲，劉小琳，周水平，黃競怡，
申請(專利權)人：天士力制藥集團股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：天津;12