具有木糖異構酶活性的嵌合多肽制造技術

本發明專利技術提供了能夠將木糖轉化為木酮糖的嵌合多肽，表達該嵌合多肽的工程化宿主細胞，構建該嵌合多肽的方法，以及發酵纖維素生物質以生產包括乙醇的生物燃料的方法。

Chimeric polypeptide with xylose isomerase activity

The present invention provides a chimeric polypeptide to convert xylose to xylulose, expression of engineered host cells the chimeric polypeptide and method of constructing the chimeric polypeptide, and fermentation of cellulosic biomass to ethanol production methods including biofuels.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】具有木糖異構酶活性的嵌合多肽聯邦資助的研究或開發根據合同DE-PS02-06ER64304，本專利技術部分由生物能源科學中心(theBioenergyScienceCenter)橡樹嶺國家實驗室(OakRidgeNationalLaboratory)—由生物和環境研究辦公室(theOfficeofBiologicalandEnvironmentalResearch)支持的美國能源部(U.S.DepartmentofEnergy)的生物能源研究中心(BioenergyResearchCenter)資助。政府對本專利技術享有一定的權利。專利
總的來說，本專利技術的領域涉及能夠將木糖轉化為木酮糖的嵌合多肽，表達該嵌合多肽的工程化宿主細胞，構建嵌合多肽的方法，以及發酵纖維素生物質以生產包括乙醇的生物燃料的方法。專利技術背景釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是在由諸如玉米、甘蔗和甜菜的糖基底物商業化生產“第一代”燃料乙醇中使用的主要生物催化劑。第二代乙醇生產，也稱為纖維素乙醇生產，使碳水化合物來源擴展到更復雜的多糖，如纖維素和半纖維素，其占大多數植物細胞壁的很大一部分，因此占大多數植物材料的很大一部分。商業上考慮的用于第二代乙醇生產的原料包括木材，農業殘渣如玉米秸稈和小麥秸稈，甘蔗渣和有目的種植的材料(purposegrownmaterial)如柳枝稷。纖維素和半纖維素必須水解成單體糖，然后使用機械/化學手段和/或酶水解發酵。釋放的單體糖包括葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖，而在大多數原料中，葡萄糖和木糖占單體糖的75％以上。為了使纖維素乙醇生產在經濟上可行并與第一代乙醇競爭，生物催化劑必須能夠使大多數(如果不是全部)的可用糖轉化為乙醇。由于釀酒酵母的耐用性、高產率和多年的安全使用，其為用于第一代乙醇生產的優選生物。然而，天然存在的釀酒酵母不能將木糖發酵為乙醇。為了使釀酒酵母成為用于第二代乙醇生產的可行的生物催化劑，其必須能夠發酵木糖。已經證明了在釀酒酵母中有兩種木糖發酵的代謝途徑。所述途徑的主要差異在于木糖向木酮糖的轉化。在第一種途徑XR-XDH途徑中，木糖還原酶(XR)將木糖轉化為木糖醇，其隨后由木糖醇脫氫酶(XDH)轉化為木酮糖。迄今為止，所測試的XR和XDH酶對所需要的輔因子不同，NADH和NADPH，導致難以實現氧化還原平衡。第二種通常嘗試的途徑使用木糖異構酶(XI)使木糖直接轉化為木酮糖，不需要氧化還原輔因子。來自細菌和真菌系統的XI已經成功地用于釀酒酵母中。兩種途徑均利用相同的下游代謝工程化：上調天然木酮糖激酶(XKS1)和戊糖磷酸途徑的四種基因，具體是核酮糖-磷酸3-差向異構酶(RPE1)、核糖-5-磷酸酮醇-異構酶(RKI1)、轉醛醇酶(TAL1)和轉酮醇酶(TKL1)(圖1)。使用XI途徑還通常需要刪除天然醛糖還原酶基因(GRE3)以消除由于木糖醇形成引起的產物損失。專利技術簡述本專利技術的方面涉及能夠將木糖直接轉化為木酮糖的新的嵌合多肽，并且本文描述了其構建和使用方法。在一些實施方案中，本專利技術涉及表達一種或多種嵌合多肽的宿主細胞。在本專利技術的一些實施方案中，嵌合多肽與SEQIDNO:1、3、5、7和/或9中任一條具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些實施方案中，嵌合多肽具有SEQIDNO:1、3、5、7或9的氨基酸序列。在本專利技術的一些實施方案中，嵌合多肽與SEQIDNO:25具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些實施方案中，嵌合多肽具有SEQIDNO:25的氨基酸序列。在本專利技術的一些實施方案中，嵌合多肽與SEQIDNO:27具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些實施方案中，嵌合多肽具有SEQIDNO:27的氨基酸序列。在一些實施方案中，嵌合多肽由與SEQIDNO:2、4、6、8和/或10中任一條具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的多核苷酸序列編碼。在一些實施方案中，嵌合多肽由SEQIDNO:2、4、6、8或10的多核苷酸序列編碼。在一些實施方案中，多核苷酸序列包含在載體中。在一些實施方案中，嵌合多肽由與SEQIDNO:26具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的多核苷酸序列編碼。在一些實施方案中，嵌合多肽由SEQIDNO:26的多核苷酸序列編碼。在一些實施方案中，多核苷酸序列包含在載體中。在一些實施方案中，嵌合多肽由與SEQIDNO:28具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的多核苷酸序列編碼。在一些實施方案中，嵌合多肽由SEQIDNO:28的多核苷酸序列編碼。在一些實施方案中，多核苷酸序列包含在載體中。在本專利技術的一些方面，通過組合兩個或多個來自現有的XI的片段構建嵌合多肽。在一些實施方案中，從來自如多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、軟弱貧養菌(Abiotrophiadefectiva)、狄氏副擬桿菌(Parabacteroidesdistasonis)、松噬幾丁質菌(Chitinophagapinensis)、Cyllamycesaberensis、瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)和/或相關細菌的核苷酸序列分離供體XI序列。在一些實施方案中，核苷酸序列是經密碼子優化的，例如，用于在酵母中表達。在一些實施方案中，一條或多條供體XI序列具有與SEQIDNO:12、14、16、18、20、22或24中本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種多肽，其包含與選自SEQ?ID?NO:1、3、5、7、9、25和27的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.08.11 US 62/0357521.一種多肽，其包含與選自SEQIDNO:1、3、5、7、9、25和27的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。2.一種多肽，所述多肽包含C-末端區域和N-末端區域，其中所述多肽的C-末端區域包含至少5個來自SEQIDNO:13的氨基酸序列的連續氨基酸，并且所述多肽的N-末端區域包含至少5個來自選自SEQIDNO:11、15、17、23或其組合的氨基酸序列的連續氨基酸。3.權利要求2所述的多肽，其中所述多肽的N-末端區域包含至少5個來自選自SEQIDNO:11、23及其組合的氨基酸序列的連續氨基酸。4.權利要求2所述的多肽，其中所述多肽的N-末端區域包含至少5個來自選自SEQIDNO:11、17、15及其組合的氨基酸序列的連續氨基酸。5.一種多肽，其包含C-末端區域和N-末端區域，其中所述C-末端區域包含至少5個來自SEQIDNO:15的氨基酸序列的連續氨基酸，并且所述N-末端區域包含至少5個來自選自SEQIDNO:19、21、23及其組合的氨基酸序列的連續氨基酸。6.權利要求1-5中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含：a.存在于188-196位的氨基酸VXW[GP]GREG[YSTA]，其中“X”為任何氨基酸，并且其中括號中的氨基酸表示帶括號的氨基酸之一可以存在于該位置；b.存在于233-240位的氨基酸[LIVM]EPKPX[EQ]P，其中“X”可以是任何氨基酸，并且其中括號中的氨基酸表示帶括號的氨基酸之一可以存在于該位置；和c.在103位的His殘基，在106位的Asp殘基和在341位的Asp殘基；其中所述位置是指參考SEQIDNO:11的氨基酸序列中的位置。7.一種多核苷酸，其具有編碼權利要求1-6中任一項所述的氨基酸序列的核苷酸序列。8.權利要求7所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列經密碼子優化。9...

【專利技術屬性】
技術研發人員：A·弗勒利希，B·漢寧森，
申請(專利權)人：拉勒曼德匈牙利流動管理有限責任公司，
類型：發明
國別省市：匈牙利,HU