一種檢測(cè)外周血中卵巢癌細(xì)胞標(biāo)志物的試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種檢測(cè)外周血中卵巢癌細(xì)胞標(biāo)志物的試劑盒，包括結(jié)合有卵巢癌抗體的磁珠及相應(yīng)緩沖試劑，該試劑盒采用磁珠分選，RT?PCR等分子生物學(xué)的方法檢測(cè)卵巢癌患者血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性，確定藥物治療靶點(diǎn)的基因，通過(guò)檢測(cè)EpCAM?2、Muc1、Her2，Wt?1、Pax8和P16的表達(dá)水平，確定卵巢癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，對(duì)卵巢癌的個(gè)性化治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本發(fā)明專利技術(shù)提供的試劑盒檢測(cè)樣本量小，對(duì)患者傷害小，檢測(cè)靈敏度高，檢出率可達(dá)100％。

A kit for detecting ovarian cancer cell markers in peripheral blood

The invention provides a kit for ovarian cancer cell markers in peripheral blood, including ovarian cancer antibody combined with magnetic beads and the corresponding buffer reagent, the kit using magnetic bead sorting method, the biological activity of RT PCR and other molecular biology detection of blood circulation in patients with ovarian cancer tumor cells, determine drug treatment the target gene detected by EpCAM 2, Muc1, Her2, the expression level of Wt 1 and Pax8 and P16, determine the development and prognosis of ovarian cancer, and provide a theoretical basis and experimental evidence for personalized treatment of ovarian cancer. The test kit provided by the invention has small sample size, small damage to the patient, high detection sensitivity and a detection rate of up to 100%.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種檢測(cè)外周血中卵巢癌細(xì)胞標(biāo)志物的試劑盒
本專利技術(shù)屬于生物
，涉及一種卵巢癌檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種準(zhǔn)確性高的檢測(cè)外周血中卵巢癌細(xì)胞標(biāo)志物的試劑盒。
技術(shù)介紹
1.1卵巢癌概述卵巢癌(ovariancancer)是女性生殖系統(tǒng)三個(gè)惡性腫瘤之一，是當(dāng)今致死率最高的婦科腫瘤，每年約2萬(wàn)人被診斷為該疾病，造成全球每年約114,000女性死于該疾病，而每位女性一生中約1/73的概率發(fā)生該疾病。上皮性卵巢癌(epithelialovariancancer)占所有卵巢腫瘤的90％，按其病理組織學(xué)形態(tài)的不同，可分為漿液性(serous)、粘液性(mucinous)、子宮內(nèi)膜樣(endometrioid)、透明細(xì)胞癌(clearcellcarcinoma)與移行細(xì)胞癌(transitionalcellscarcinoma)5種類型，其中漿液性卵巢癌最多，占全部上皮性卵巢癌的50％以上。卵巢癌危險(xiǎn)因素有持續(xù)排卵、遺傳因素、內(nèi)分泌因素、年齡、環(huán)境因素等，關(guān)于上皮性卵巢癌的起源目前還不明確，較廣泛接受的學(xué)說(shuō)有卵巢表面生發(fā)上皮學(xué)說(shuō)、第二繆勒系統(tǒng)學(xué)說(shuō)、輸卵管起源學(xué)說(shuō)和干細(xì)胞學(xué)說(shuō)等。以往人們認(rèn)為卵巢癌轉(zhuǎn)移的主要途徑是局部浸潤(rùn)、腹腔種植、淋巴轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移等，其中以腹腔種植為多，但是近年來(lái)研究，血行轉(zhuǎn)移除了造成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移外，也是造成腹腔網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶形成原因之一，因此血行轉(zhuǎn)移也是不容忽視的轉(zhuǎn)移途徑。上皮性卵巢癌(epithelialovariancancer，EOC)占所有卵巢腫瘤的90％，由于卵巢癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，因此大部分患者就診時(shí)已到晚期，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其死亡的主要原因，因此早期診斷、及早發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移在減少卵巢癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、提高生存率等方面具有重要的意義。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells，CTCs)為原發(fā)腫瘤組織和轉(zhuǎn)移灶脫落入血形成的，其除介導(dǎo)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移外有研究表明也介導(dǎo)卵巢癌的種植性轉(zhuǎn)移，因此CTC可以提示腫瘤進(jìn)展及判斷預(yù)后，由于外周血樣本易獲得且創(chuàng)傷小等特點(diǎn)顯示出了CTC的臨床優(yōu)勢(shì)。1.2影響卵巢癌預(yù)后的相關(guān)因素造成卵巢癌預(yù)后如此之差的相關(guān)因素中影響最大的是卵巢癌晚期轉(zhuǎn)移，臨床上大部分卵巢癌患者死于卵巢癌轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的腸梗阻、電解質(zhì)紊亂、惡液質(zhì)、腎臟等多器官功能衰竭。由于卵巢癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，70％患者就診時(shí)已到晚期(Ⅲ，Ⅳ期)，患者表現(xiàn)為向周圍組織浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移累計(jì)盆腹腔多個(gè)臟器造成腹痛、腰痛、下肢疼痛、下肢浮腫、腹水等臨床表現(xiàn)，此時(shí)五年生存率小于30％，但是若早期(Ⅰ，Ⅱ期)診斷和治療局部病灶，則五年生存期將高達(dá)90％，由此可知，高敏感性或高特異性的甄選以及監(jiān)測(cè)腫瘤的進(jìn)展方法對(duì)于卵巢癌的診治具有十分重要的意義。目前FIGO將卵巢癌的分期大致分為4期，Ⅰ期為局限于卵巢部位，Ⅱ期為腫瘤累及一側(cè)或雙側(cè)卵巢，伴有盆腔轉(zhuǎn)移或腹膜癌，Ⅲ期為除了腫瘤累及一側(cè)或雙側(cè)卵巢或輸卵管，或原發(fā)性腹膜癌外，伴有細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)確認(rèn)的盆腔外腹膜播散，和(或)轉(zhuǎn)移至腹膜后淋巴結(jié)，Ⅳ期為存在腹腔之外的轉(zhuǎn)移。表1詳細(xì)的列出了為2014年FIGO卵巢癌分期標(biāo)準(zhǔn)。表1：2014年FIGO有關(guān)卵巢癌分期系統(tǒng)注1：包括腫瘤蔓延至肝臟和脾臟包膜，但不包括臟器實(shí)質(zhì)的受累。注2：臟器實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移屬于IVB期。1.3臨床常用卵巢癌檢測(cè)技術(shù)目前臨床上針對(duì)卵巢癌的常規(guī)檢測(cè)有血清學(xué)檢測(cè)和免疫組化檢測(cè)，血清學(xué)檢測(cè)包括癌抗原125(CA125)，癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(CEA)，CA19-9等，CA125是目前應(yīng)用最廣泛的腫瘤標(biāo)記物，其在正常的卵巢組織中不存在，最常見(jiàn)于EOC患者的血清中，粘液性卵巢癌中不表達(dá)。當(dāng)作為單獨(dú)的標(biāo)記物，CA125只在47％的早期卵巢癌患者中高表達(dá)，在晚期卵巢癌患者中80-90％會(huì)提高，故不用于卵巢癌的早期診斷，另外CA125在其他腫瘤如乳腺癌，前列腺癌，胃癌等也會(huì)有提高，而且CA125在月經(jīng)期、懷孕等良性婦科狀態(tài)及盆腔炎癥時(shí)也會(huì)提高，所以CA125作為卵巢癌標(biāo)記物缺乏足夠的敏感性和特異性。免疫組織檢測(cè)的指標(biāo)包括增殖細(xì)胞核相關(guān)抗原KI67，抑癌基因p53等，其中ki67的免疫組化結(jié)果成為反應(yīng)腫瘤增殖潛能的指標(biāo)，是卵巢癌惡性度的指標(biāo)，可鑒別卵巢良性、交界性、惡性腫瘤的指標(biāo)，另外其在卵巢癌中高表達(dá)與預(yù)后差相關(guān)，但其以病理組織為樣本，創(chuàng)傷性較大，無(wú)法作為檢測(cè)腫瘤進(jìn)展的指標(biāo)，因此臨床需要一種創(chuàng)傷小，有助于早期診斷且能實(shí)時(shí)檢測(cè)腫瘤進(jìn)展的有效的檢測(cè)方法。1.4卵巢癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制長(zhǎng)久以來(lái)，人們一直被“是什么決定了哪個(gè)器官發(fā)生轉(zhuǎn)移”這個(gè)問(wèn)題所困擾，1889年，StephenPaget觀察到乳腺癌患者更偏向發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，Pagett認(rèn)為這是不尋常的因?yàn)槠渌钠鞴偃缙⑴K也會(huì)同樣的收到相同的影響，因?yàn)槠⑴K和肝臟有相同的血流量，這個(gè)發(fā)現(xiàn)促使Pagett提出了“種子-土壤”學(xué)說(shuō)，他假設(shè)某些腫瘤細(xì)胞，也就是種子，選擇性克隆至遠(yuǎn)端器官，也就是土壤，其提供了一個(gè)適合腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境“當(dāng)植物開始播種，它的種子可以播撒向任何方向但是其只會(huì)落在合適的土壤中生長(zhǎng)”因此某些器官必須提供合適的適合器官特異性轉(zhuǎn)移的環(huán)境從而導(dǎo)致器官的選擇性。卵巢癌轉(zhuǎn)移部位的不同也驗(yàn)證了此假說(shuō)，以往認(rèn)為被動(dòng)和重復(fù)的腹腔暴露于脫落的腫瘤細(xì)胞是導(dǎo)致腹膜疾病的主導(dǎo)原因，但是臨床上有一部患者在初診的時(shí)候有腹膜后或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移如肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移另外，即使在腹腔中，間皮疾病的存在也提示其他轉(zhuǎn)移途徑的存在。SunilaPradee等人建立了表明卵巢癌血行轉(zhuǎn)移偏向于大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的異體共存小鼠模型，其研究揭示了NRG1軸是血行轉(zhuǎn)移至大網(wǎng)膜的主要通路，卵巢癌細(xì)胞高表達(dá)ErbB3和大網(wǎng)膜表達(dá)NRG1是腫瘤細(xì)胞定居和生長(zhǎng)的原因，低表達(dá)ErbB3減少了大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移，其研究強(qiáng)調(diào)了卵巢癌血行轉(zhuǎn)移在卵巢癌轉(zhuǎn)移中的重要地位。1.5循環(huán)腫瘤細(xì)胞循環(huán)腫瘤細(xì)胞是指原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶脫落入血的腫瘤細(xì)胞，第一次被提出是在1869年，部分入血的CTC可能具備了在組織支持的微環(huán)境中克隆生長(zhǎng)形成轉(zhuǎn)移灶的能力，因此CTC數(shù)目和分子特征可以作為一種實(shí)時(shí)無(wú)創(chuàng)的實(shí)時(shí)“液體活檢”手段提供關(guān)于預(yù)后、治療選擇及有效性等臨床信息。現(xiàn)今CTC研究已成為相當(dāng)活躍的領(lǐng)域，大量研究表明了CTC在惡性腫瘤中的存在及其臨床意義，這些研究提示CTC是預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，CTC檢測(cè)陽(yáng)性患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期明顯短于CTC檢測(cè)陰性的患者，而有效的細(xì)胞減滅術(shù)或放化療后CTC數(shù)目下降，提示CTC可以輔助檢測(cè)治療效果從而對(duì)進(jìn)一步的治療做出指導(dǎo)；另外，CTC中還會(huì)攜帶原發(fā)組織的遺傳信息，通過(guò)分子水平的變化可以為個(gè)體化治療提供依據(jù)。在卵巢癌特別是漿液性癌中，EpCAM、HER2、MUC1、PAX8、WT-1和P16的高表達(dá)，預(yù)示著卵巢癌的轉(zhuǎn)歸，其中EpCAM、HER2、MUC1和P16的高表達(dá)與卵巢癌的預(yù)后有關(guān)，而PAX8、WT-1的共同表達(dá)是區(qū)分卵巢癌和乳腺癌的關(guān)鍵因子。綜上所述，檢測(cè)卵巢癌患者血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量對(duì)于卵巢癌診斷及評(píng)估預(yù)后具有重大的理論和實(shí)際意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種可以準(zhǔn)確檢測(cè)卵巢癌標(biāo)志物的試劑盒，主要是指一種通過(guò)采集卵巢癌患者外周血液中的卵巢癌細(xì)胞的檢測(cè)試劑盒及復(fù)合的檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)是一種準(zhǔn)確性高的檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞(惡本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)外周血中卵巢癌細(xì)胞標(biāo)志物的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由如下組分組成：結(jié)合有卵巢癌抗體的磁珠：結(jié)合有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠；緩沖液A?100?200mL；緩沖液B?100?200mL；裂解/結(jié)合緩沖液?150?250mL；10×緩沖液?4.0?5.0mL；dNTPs，5mM?each?4.0?5.0mL；逆轉(zhuǎn)錄酶，10000U/μL?2.0?3.0mL；RNA酶抑制劑，40U/μL?0.4?0.6mL；2×熱啟動(dòng)PCR混合液?2?3mL；RNase?free水?1?2mL；卵巢癌腫瘤標(biāo)志物引物10μmol/L?3.0?5.0mL；其中所述卵巢癌腫瘤標(biāo)志物為EpCAM、Her2、Muc1、Pax8、wt?1、P16中的一種或多種；所述EpCAM引物序列為：上游引物如SEQ?ID?NO：1所示；下游引物如SEQ?ID?NO：2所示；所述Her2引物序列為：上游引物如SEQ?ID?NO：3所示；下游引物如SEQ?ID?NO：4所示；所述Muc?1引物序列為：上游引物如SEQ?ID?NO：5所示；下游引物如SEQ?ID?NO：6所示；所述Pax8引物序列為：上游引物如SEQ?ID?NO：7所示；下游引物如SEQ?ID?NO：8所示；所述Wt?1引物序列為：上游引物如SEQ?ID?NO：9所示；下游引物如SEQ?ID?NO：10所示；所述P16引物序列為：上游引物如SEQ?ID?NO：11所示；下游引物如SEQ?ID?NO：12所示；所述卵巢癌抗體為抗EpCAM單克隆抗體、抗MUC1單克隆抗體和抗HER?2單克隆抗體。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測(cè)外周血中卵巢癌細(xì)胞標(biāo)志物的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由如下組分組成：結(jié)合有卵巢癌抗體的磁珠：結(jié)合有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠；緩沖液A100-200mL；緩沖液B100-200mL；裂解/結(jié)合緩沖液150-250mL；10×緩沖液4.0-5.0mL；dNTPs，5mMeach4.0-5.0mL；逆轉(zhuǎn)錄酶，10000U/μL2.0-3.0mL；RNA酶抑制劑，40U/μL0.4-0.6mL；2×熱啟動(dòng)PCR混合液2-3mL；RNase-free水1-2mL；卵巢癌腫瘤標(biāo)志物引物10μmol/L3.0-5.0mL；其中所述卵巢癌腫瘤標(biāo)志物為EpCAM、Her2、Muc1、Pax8、wt-1、P16中的一種或多種；所述EpCAM引物序列為：上游引物如SEQIDNO：1所示；下游引物如SEQIDNO：2所示；所述Her2引物序列為：上游引物如SEQIDNO：3所示；下游引物如SEQIDNO：4所示；所述Muc1引物序列為：上游引物如SEQIDNO：5所示；下游引物如SEQIDNO：6所示；所述Pax8引物序列為：上游引物如SEQ...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：牛剛，譚煥然，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：牛剛，譚煥然，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京,11