一種芽孢桿菌的發(fā)酵方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域的一種芽孢桿菌的發(fā)酵方法。芽孢桿菌經(jīng)一、二級種子擴大培養(yǎng)后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，期間通過補料流加碳源和發(fā)酵培養(yǎng)基中相對缺乏的限制性氨基酸，經(jīng)噴霧干燥得到的每克菌粉芽孢桿菌CFU不少于2.3×10

A fermentation method of Bacillus

The invention discloses a Bacillus fermentation method belonging to the field of microbial fermentation technology. The Bacillus spore was cultivated in the fermentation medium after the one or two stage seeds were expanded and cultured. During the period, the Bacillus powdered Bacillus per gram of Bacillus CFU was less than 2.3 * 10 through the feed flow plus carbon source and the relative deficiency of the limited amino acid in the fermentation medium.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種芽孢桿菌的發(fā)酵方法
本專利技術(shù)屬于微生物發(fā)酵
，具體涉及一種芽孢桿菌的發(fā)酵方法。
技術(shù)介紹
玉米赤霉烯酮(ZEN)又稱F-2毒素，是一類2，4-二羥基苯甲酸的內(nèi)酯化合物，具有類雌性激素作用，可與子宮內(nèi)雌激素受體不可逆結(jié)合，從而影響動物的生殖生理。玉米赤霉烯酮對畜牧業(yè)及人類產(chǎn)生嚴(yán)重的危害，因此，有效控制和解決ZEN對糧食和飼料的污染，對改善動物生產(chǎn)性能和提高人類食品安全有非常重要的意義?？茖W(xué)工作者們對該毒素的解毒去除方法進行了不斷研究，總結(jié)國內(nèi)外研究者關(guān)于ZEN除毒去毒方法，主要包括物理去毒法、化學(xué)去毒法和微生物及生物酶降解法。傳統(tǒng)的理化方法對ZEN去毒均不理想，從而限制了在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。申請公布號為CN102181376A的專利技術(shù)專利公開了一種同時降解玉米赤霉烯酮和纖維素的枯草芽孢桿菌BacillussubtilisANSB01G(保藏編號為CGMCCNo.4297)。并公開其培養(yǎng)方法為，取活菌濃度為109CFU/ml的枯草芽孢桿菌0.5-2.5ml，接種于50-100ml培養(yǎng)基中，在30-40℃進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)20-30h，轉(zhuǎn)速180-220r/min，pH值7.0-7.4。取枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液600-800μl，加入500ppb的玉米赤霉烯酮150-200μl，將反應(yīng)體系的pH值調(diào)節(jié)為7.0-7.4，在36-38℃反應(yīng)2-72h，枯草芽孢桿菌ANSB01G對玉米赤霉烯酮的降解率達到83％。申請公開號為CN104232526A的專利技術(shù)專利公開了一種枯草芽孢桿菌活菌制劑的制備工藝，枯草芽孢桿菌ANSB01G活菌制備工藝需要同時兼顧活菌數(shù)和玉米赤霉烯酮降解活性，CN104232526A中提供的發(fā)酵方法不能滿足枯草芽孢桿菌ANSB01G發(fā)揮最佳的玉米赤霉烯酮降解特性。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)為了解決上述存在的技術(shù)問題，提出一種芽孢桿菌的發(fā)酵方法。具體技術(shù)方案如下：一種芽孢桿菌的發(fā)酵方法，包括如下步驟：(1)一級種子制備：取芽孢桿菌菌種懸濁液接種于一級種子培養(yǎng)基中，然后進行培養(yǎng)；(2)二級種子制備：將一級種子接種于二級種子培養(yǎng)基中，然后進行培養(yǎng)；(3)發(fā)酵：將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后進行發(fā)酵培養(yǎng)；當(dāng)發(fā)酵至8-10h時流加補料培養(yǎng)基A，發(fā)酵至12-17h時流加補料培養(yǎng)基B；所述補料培養(yǎng)基A包含質(zhì)量百分比10％-20％的碳源；所述補料培養(yǎng)基B包含質(zhì)量百分比5％-10％的碳源和質(zhì)量百分比1.8％-9.5％發(fā)酵培養(yǎng)基中缺乏的菌種限制性氨基酸。所述芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌。所述一級種子培養(yǎng)基包括的原料為：每1000mL，包括胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1.5-3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化鈉3-6g、磷酸氫二鈉2.5-4g、七水硫酸鎂0.5-1.5g，蒸餾水1000mL，pH為7.0-7.4；所述二級種子培養(yǎng)基包括的原料按質(zhì)量百分比為：葡萄糖0.5％-3％，酵母抽提物0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，磷酸氫二鉀0.02％-0.05％，氯化鈉0.5％-1％，硫酸鎂0.02％-0.1％，培養(yǎng)基pH為6.5-7.5；所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括的原料按質(zhì)量百分比為：葡萄糖0.5％-2.5％，豆柏1.5％-4％，玉米漿1％-5％，酵母粉1％-3％，蛋白胨1％-3％，磷酸氫二鉀0.01％-0.05％，硫酸鎂0.1％-0.2％，硫酸錳0.002％，培養(yǎng)基pH為6.5-7.5。所述芽孢桿菌菌種懸濁液濃度為1×1010-2×1011cfu/mL，將芽孢桿菌菌種懸濁液按照體積百分比1％-5％接種于一級種子培養(yǎng)基中；將含有一級種子的一級種子培養(yǎng)基按照體積百分比1％-5％接種于二級種子培養(yǎng)基中；將含有二級種子的二級種子培養(yǎng)基按照體積百分比1％-5％接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。步驟(1)中所述培養(yǎng)條件為：溫度37℃-40℃，時間16-24h，轉(zhuǎn)速180-200r/min；步驟(2)中所述培養(yǎng)條件為：溫度30℃-35℃，時間8-10h，轉(zhuǎn)速180-200r/min；步驟(3)中所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度為30℃-35℃，時間24-36h，發(fā)酵罐罐壓為0.02Mpa-0.05Mpa，轉(zhuǎn)速180-200r/min。所述補料培養(yǎng)基A和補料培養(yǎng)基B的流加量均為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.1-1.0‰；所述碳源為葡萄糖，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中缺乏的菌種限制性氨基酸為賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和精氨酸。所述補料培養(yǎng)基A的的原料及用量為：葡萄糖10％-20％，培養(yǎng)基pH為6.5-7.5；所述補料培養(yǎng)基B的原料及用量為：葡萄糖5％-10％，賴氨酸1.0％-4.0％，苯丙氨酸0.5％-3.0％，蛋氨酸0.2％-1.5％，精氨酸0.1％-1.0％，培養(yǎng)基pH為6.5-7.5。所述發(fā)酵培養(yǎng)基裝入量為發(fā)酵罐有效容積的50％-70％。本專利技術(shù)的有益效果為：(1)本專利技術(shù)枯草芽孢桿菌ANSB01G經(jīng)一、二級種子擴大培養(yǎng)后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，期間通過流加補料技術(shù)補充碳源和發(fā)酵培養(yǎng)基中相對缺乏的限制性氨基酸(賴氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸和精氨酸)，增加了枯草芽孢桿菌的數(shù)量和芽孢轉(zhuǎn)化率，經(jīng)噴霧干燥每克菌粉枯草芽孢桿菌CFU不少于2.3×1011個，芽孢率大于93％，與原有分批發(fā)酵工藝相比，顯著提高了單位產(chǎn)量，降低了單位成本。(2)本專利技術(shù)制備的枯草芽孢桿菌ANSB01G用于玉米赤霉烯酮的降解，48h后體系中玉米赤霉烯酮的降解率可達到92％。(3)本專利技術(shù)流加補料發(fā)酵技術(shù)實現(xiàn)了發(fā)酵活菌數(shù)、轉(zhuǎn)化芽孢率、降解玉米赤霉烯酮活性三個指標(biāo)同時達到最佳，在枯草芽孢桿菌ANSB01G工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中具有降本增效作用，并對其他芽孢桿菌發(fā)酵工藝革新具有借鑒意義。具體實施方式以下實施例用于說明本專利技術(shù)，但不用來限制本專利技術(shù)的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。在以下實施例中使用的枯草芽孢桿菌ANSB01G，已于2010年11月4日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCCNo.4297，在中國專利文獻CN102181376A中公開。實施例1：本專利技術(shù)涉及的枯草芽孢桿菌ANSB01G的發(fā)酵方法枯草芽孢桿菌ANSB01G的發(fā)酵方法，步驟如下：(1)一級種子制備：250mL三角瓶裝有100mL一級種子培養(yǎng)基，115℃濕熱滅菌20min，取1mLANSB01G活菌凍干管菌種接種于一級種子培養(yǎng)基中，于溫度37℃，轉(zhuǎn)速180r/min條件下培養(yǎng)16h。一級種子培養(yǎng)基配方(g/L)為：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化鈉4g、磷酸氫二鈉3g、七水硫酸鎂1g、蒸餾水1000ml，pH值為7.2。(2)二級種子制備：在500L發(fā)酵罐中裝有300L二級種子培養(yǎng)基，115℃濕熱滅菌20min，按照1:100比例將一級種子接種于二級種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)10h。二級種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖3％，酵母抽提物3％，蛋白胨0.5％，磷酸氫二鉀0.05％，氯化鈉1％，硫酸鎂0.1％，培養(yǎng)基pH為7.0。(3)發(fā)酵：在40m3發(fā)酵罐中裝有30m3發(fā)酵培養(yǎng)基，115℃濕熱滅菌20min，將300L二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制罐壓0.02Mpa，在30℃培養(yǎng)36h。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖2.5％，豆柏1％，玉米漿1％，酵母粉1％，本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種芽孢桿菌的發(fā)酵方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)一級種子制備：取芽孢桿菌菌種懸濁液接種于一級種子培養(yǎng)基中，然后進行培養(yǎng)；(2)二級種子制備：將一級種子接種于二級種子培養(yǎng)基中，然后進行培養(yǎng)；(3)發(fā)酵：將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后進行發(fā)酵培養(yǎng)；當(dāng)發(fā)酵至8?10h時流加補料培養(yǎng)基A，發(fā)酵至12?17h時流加補料培養(yǎng)基B；所述補料培養(yǎng)基A包含質(zhì)量百分比10％?20％的碳源；所述補料培養(yǎng)基B包含質(zhì)量百分比5％?10％的碳源和質(zhì)量百分比1.8％?9.5％發(fā)酵培養(yǎng)基中缺乏的菌種限制性氨基酸。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種芽孢桿菌的發(fā)酵方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)一級種子制備：取芽孢桿菌菌種懸濁液接種于一級種子培養(yǎng)基中，然后進行培養(yǎng)；(2)二級種子制備：將一級種子接種于二級種子培養(yǎng)基中，然后進行培養(yǎng)；(3)發(fā)酵：將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后進行發(fā)酵培養(yǎng)；當(dāng)發(fā)酵至8-10h時流加補料培養(yǎng)基A，發(fā)酵至12-17h時流加補料培養(yǎng)基B；所述補料培養(yǎng)基A包含質(zhì)量百分比10％-20％的碳源；所述補料培養(yǎng)基B包含質(zhì)量百分比5％-10％的碳源和質(zhì)量百分比1.8％-9.5％發(fā)酵培養(yǎng)基中缺乏的菌種限制性氨基酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述一級種子培養(yǎng)基包括的原料為：每1000mL，包括胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1.5-3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化鈉3-6g、磷酸氫二鈉2.5-4g、七水硫酸鎂0.5-1.5g，蒸餾水1000mL，pH為7.0-7.4。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述二級種子培養(yǎng)基包括的原料按質(zhì)量百分比為：葡萄糖0.5％-3％，酵母抽提物0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，磷酸氫二鉀0.02％-0.05％，氯化鈉0.5％-1％，硫酸鎂0.02％-0.1％，培養(yǎng)基pH為6.5-7.5。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括的原料按質(zhì)量百分比為：葡萄糖0.5％-2.5％，豆柏1.5％-4％，玉米漿1％-5％，酵母粉1％-3％，蛋白胨1％-3％，磷酸氫二鉀0.01％-0.05％，硫酸鎂0.1％-0.2％，硫酸錳0.0...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馬秋剛，趙麗紅，計成，郭永鵬，鄭文革，
申請(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：北京,11