一株解淀粉芽孢桿菌及其應用制造技術

本發明專利技術屬于生物技術領域，具體涉及一株解淀粉芽孢桿菌及其應用。采取的技術方案是：從種植蘆筍的土壤中篩選分離出一株具有幾丁質降解能力的解淀粉芽孢桿菌MY001,2017年7月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,菌種名稱:解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)MY001.，保藏編號為：CGMCC?NO.14460。該菌株可用于蘆筍莖枯病防治，具體使用方法為：將濃度為1×10

Bacillus amyloid bacillus and its application

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a strain of Bacillus amylum and its application. The technical scheme is: screening and separating a Bacillus amylum with chitin degradation ability from the soil of Asparagus Planting, which is stored in the general microorganism center of the China microbe preservation management committee in July 26th MY0012017, the name of the strain: Bacillus amyloliquefaciens MY001., and preservation The number is: CGMCC NO.14460. The strain can be used for the control of asparagus stem blight. The specific method of use is: the concentration is 1 x 10.

【技術實現步驟摘要】
一株解淀粉芽孢桿菌及其應用
本專利技術屬于生物
，具體涉及一株解淀粉芽孢桿菌及其應用。
技術介紹
蘆筍莖枯病(Asparagusstemblight)又被稱為蘆筍的“癌癥”，其發病癥狀主要集中于莖、側枝或葉，具有發病快、易傳染、損失嚴重的特點，一旦有蘆筍感染，很容易大面積傳播，導致整片蘆筍植株突然變黃枯萎，不能有效產出蘆筍產品。其主要致病病原菌為天門冬擬莖點霉(Phomopsisasparagi)。目前對蘆筍莖枯病的防治，主要使用多菌靈、百菌清等化學農藥，但長期使用該類化學農藥，容易導致病菌產生抗藥性，無法持續地對蘆筍莖枯病進行有效防治。因此，開發有效的生物農藥是防治蘆筍莖枯病的可行方法。芽胞桿菌廣泛分布于自然界,包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等，這些菌株對外界有害因子抵抗力強。很多種芽孢桿菌具有抑制農作物病原菌繁殖生長的作用,是良好的生防細菌。解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)屬于革蘭氏陽性菌，已經發現,解淀粉芽孢桿菌對植物病原菌具有廣譜抑菌性，但其抑菌的有效性仍具有極強的特異性，針對不同的病原菌需要篩選出特異的生防菌株才能達到最佳抑菌效果。而將解淀粉芽孢桿菌應用于植物真菌病害防治的研究，大多集中在草莓、番茄、桃、土豆等作物上，特異性防治蘆筍莖枯病的解淀粉芽孢桿菌尚未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一株解淀粉芽孢桿菌及其應用。為實現上述專利技術目的，本專利技術所采用的技術方案是：一株解淀粉芽孢桿菌，2017年7月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址為中國北京，菌種名稱:解淀粉芽孢桿菌，Bacillusamyloliquefaciens，MY001.，保藏編號為：CGMCCNO.14460。相應的，其16SrDNA測序序列如SEQIDNO1所示，其gyrA測序序列如SEQIDNO2所示，其gyrB測序序列如SEQIDNO3所示。相應的，所述解淀粉芽孢桿菌在植物真菌病害防治中的應用。優選的，所述解淀粉芽孢桿菌在植物真菌病害防治中的應用，所述真菌包括：天門冬擬莖點霉菌、擬盤多毛孢屬菌、彎孢屬菌。優選的，所述解淀粉芽孢桿菌在蘆筍莖枯病中的應用。優選的，所述解淀粉芽孢桿菌用于防治蘆筍莖枯病的使用方法為：將解淀粉芽孢桿菌MY001菌劑稀釋500～1000倍,分別在蘆筍抽芽前期、蘆筍抽生期和正常生長期進行噴施，噴施頻率為間隔5～10天1次，共計噴施5～10次，整個噴施時間不超過60天。相應的，所述解淀粉芽孢桿菌在植物真菌病害防治中的應用，包括將所述解淀粉芽孢桿菌為有效成分應用于植物真菌病害防治，也包括以其代謝產物為有效成分應用于植物真菌病害防治。本專利技術具有以下有益效果：篩選分離出一株新的具有幾丁質降解能力的解淀粉芽孢桿菌，MY001,該菌株對造成蘆筍莖枯病的病原菌天門冬擬莖點霉菌等真菌具有效果極佳的抑制作用，對于防治蘆筍莖枯病具有重要的現實意義。附圖說明圖1為目標菌株形成的透明水解圈；圖2為將目標菌株與芽孢桿菌模式菌株的16SrDNA進行比對的系統進化樹；圖3為將測序結果與模式菌株的gyrA基因進行多序列比對的系統進化樹；圖4為將測序結果與模式菌株的gyrB基因進行多序列比對的系統進化樹；圖5為目標菌株對天門冬擬莖點霉菌的抑制效果對比圖；圖6為目標菌株對擬盤多毛孢屬菌株的抑制效果對比圖；圖7為目標菌株對彎孢屬菌株的抑制效果對比圖。具體實施方式實施例一：菌株的篩選1、土壤樣品采集：從綿陽蘆筍種植區采集土樣。2、配制培養基：(1)殼聚糖酶篩選培養基(g/L)：膠體殼聚糖2.0，K2HPO40.7，KH2PO40.3，(NH4)2SO45,MgSO4·7H2O0.5，FeSO4·7H2O0.01，瓊脂12.0，pH＝7.0。(2)肉湯培養基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0,NaCl5.0,pH＝7.0。3、配制試劑：配制膠體殼聚糖:稱取細粉殼聚糖10g,加入適量濃鹽酸,并在磁力攪拌器上攪拌4～6h使其充分溶解,再用去離子水反復清洗離心(4000r/min)，最后形成膠狀物，而后一邊攪拌一邊緩慢加入NaOH調節pH至中性，即得到膠體殼聚糖，于4℃保存備用。3、菌株的初篩(1)稱取5g土樣，放入盛有45mL蒸餾水的錐形瓶(250mL)中,攪拌溶解，煮沸30min，然后取上清液進行梯度稀釋(10-1,10-2,10-3,10-4,10-5共5個濃度)，各取100ul涂布于殼聚糖酶篩選培養基中(每個梯度設置2個平行)，置于37℃恒溫培養箱中培養2～4d。(2)挑取在選擇培養平板上生長且周圍有明顯透明水解圈的菌落，劃線接種于新的殼聚糖酶篩選培養基上，置于37℃恒溫培養箱中培養2d，再挑菌落劃線接種，如此進行3代篩選，得到純種菌株，即為目標菌株。(3)挑取步驟(2)得到的目標菌株單菌落于肉湯培養基中，進行液體培養。然后取5ul培養液置于直徑6mm的濾紙片上，濾紙片置于殼聚糖酶篩選培養基上，37℃恒溫培養2d，測量透明水解圈的大小。形成的透明水解圈見圖1，目標菌株產生的透明水解圈大小見表1。表1目標菌株產生的透明水解圈大小(4)將目標菌株進行提純、保種，于-80℃條件下貯存。實施例二：菌株鑒定1、16SrDNA測序鑒定提取目標菌株的基因組DNA，以細菌16SrDNA的通用引物(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R:TACGGTTACCTTGTTACGACTT)從基因組DNA中克隆16SrDNA。PCR結果送上海生工生物公司測序，將測序結果在GeneBank網站(http://www.nicbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST對比，找到并下載標準菌株的基因序列，利用MEGA7.0軟件計算不同菌株之間的遺傳距離，繪制細菌的系統發育樹。16SrDNA測序結果如SEQIDNO1所示。將目標菌株與芽孢桿菌模式菌株的16SrDNA進行比對，利用MEGA7.0構建系統進化樹，如圖3所示，其中菌株d1與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的遺傳距離最近，分別為:0.003和0.009。2、gyrA和gyrB測序鑒定促旋酶的A亞基和B亞基，作為看家蛋白，在進化上保守，大約每100萬年基因進化0.7～0.8％，比16SrDNA每5000萬年進化1％的速度更快，所以它常用于鑒定親緣關系更近，無法用16SrDNA區分開的菌株。以目標菌株的基因組DNA為模板，擴增細菌的促旋酶A和B基因。(1)gyrA為通用引物，gyrA-F：5’-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3’；gyrA-R：5’-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3’。對擴增產物進行測序，gyrA測序結果如SEQIDNO2所示。將測序結果與模式菌株的gyrA基因進行多序列比對，利用MEGA7.0構建系統進化樹，如圖4所示。其中待測菌株與Bacillusamyloliquefaciens的遺傳距離最近，為0.053(與其他菌株的遺傳距離在0.2以上)。(2)根據16SrDNA鑒定結果,根據幾種近緣種的gyrB序列的保守區，設計gyrB的引物，即gyrB-F：5’-AAC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株解淀粉芽孢桿菌，其特征在于：2017年7月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,菌種名稱:解淀粉芽孢桿菌，Bacillus?amyloliquefaciens，MY001.，保藏編號為：CGMCC?NO.14460。

【技術特征摘要】
1.一株解淀粉芽孢桿菌，其特征在于：2017年7月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,菌種名稱:解淀粉芽孢桿菌，Bacillusamyloliquefaciens，MY001.，保藏編號為：CGMCCNO.14460。2.一株解淀粉芽孢桿菌，Bacillusamyloliquefaciens，其特征在于：其16SrDNA測序序列如SEQIDNO1所示，其gyrA測序序列如SEQIDNO2所示，其gyrB測序序列如SEQIDNO3所示。3.權利要求1或2所述的解淀粉芽孢桿菌在植物真菌病害防治中的應用。4.如權利要求3所述的解淀粉芽孢桿菌在植物真菌病害防治中的應用，其特征在于：所述真菌包括：天門冬擬莖點霉菌、擬盤多毛孢屬菌、彎孢屬...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王剛剛，茍艷，謝天，蒲莉，
申請(專利權)人：中國科學院成都生物研究所，
類型：發明
國別省市：四川,51