【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及免疫學和蛋白酶活力檢測，具體涉及一種酪氨酸生物抗原、生物抗體及其制備方法與在蛋白酶活力檢測中的應用。
技術介紹
1、酪氨酸是一種含有酚羥基的芳香族極性α-氨基酸，源于酪蛋白，對紫外有吸收能力，微溶于水，溶于稀酸、稀堿。蛋白酶能夠將蛋白質和多肽水解，其活力的高低影響醬油的原料利用率、氨基酸態氮含量以及風味、色澤等物質的形成，是決定醬油質量的關鍵因素。
2、蛋白酶活力的檢測方法有熒光法、酪蛋白平板法、酪蛋白凝膠法等，熒光法的反應和檢測需要避光進行，后兩種方法水解形狀易不規則，存在人工測量、判斷等操作誤差。目前最常用的蛋白酶活力檢測方法是比色法，主要通過檢測酶水解前后，底物蛋白質濃度的減少或產物游離氨基酸或多肽濃度的增加進行量化表達，如我國gb/t?23527.1-2023中采用福林法對蛋白酶活力測定。該法檢測結果較精確，但影響該法反應體系的因素較多、專一性差且檢測有色食品時檢測結果易產生誤差。除此外，這些方法均不能立即顯示結果，不適用于工廠生產車間基層部門進行快速在線檢測和監控。因此，需專利技術一種針對蛋白酶活力的快速、簡便的檢測方法。
3、基于抗原抗體特異性結合的免疫學檢測方法具有簡便、快速、高特異性、能滿足現場檢測需求等優點。實現對蛋白酶活力的快速檢測，關鍵在于如何準確檢測蛋白酶水解酪蛋白產物酪氨酸的含量。中國專利技術專利cn?108152495?a通過檢測酪氨酸酶的含量以實現對酪氨酸的間接檢測，目前尚無有關酪氨酸的生物抗原、生物抗體以及相關應用免疫學快檢產品的報道。本專利技術制備了酪氨酸抗
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供了酪氨酸生物抗原、生物抗體及其在蛋白酶活力快速檢測中的應用。
2、根據本專利技術的一個方面，提供了酪氨酸生物抗原，由n-叔丁氧羰基-l-酪氨酸與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或乳鐵蛋白；當所述載體蛋白為牛血清白蛋白時，得到免疫用酪氨酸生物抗原；當所述載體蛋白為乳鐵蛋白時，得到包被酪氨酸生物抗原；其結構式如式(i)所示：
3、
4、根據本專利技術的另一個方面，提供了制備酪氨酸生物抗原的方法，包括以下步驟：
5、s1.n-叔丁氧羰基-l-酪氨酸溶解于有機溶劑中，加入活化劑反應，得到活化液；
6、s2.載體蛋白溶解于緩沖溶液中，加入步驟s1所得的活化液反應，得到偶聯物；
7、s3.步驟s2所得的偶聯物在鹽酸作用下叔丁酯脫除，透析后即得到所述酪氨酸生物抗原。
8、在一些實施方式中，步驟s1中所述有機溶劑為n,n-二甲基甲酰胺；所述n-叔丁氧羰基-l-酪氨酸在有機溶劑中的濃度為0.02-0.05g/ml。
9、在一些實施方式中，步驟s1中所述活化劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺；所述n-叔丁氧羰基-l-酪氨酸與活化劑的質量比為(0.5-2)：1。
10、在一些實施方式中，步驟s1中所述反應的條件為室溫避光攪拌反應3-5h，所述室溫是指10-40℃。
11、在一些實施方式中，步驟s2中所述緩沖溶液為碳酸鹽緩沖液，ph值為9.6；所述載體蛋白與酪氨酸的質量比為(2-3)：1；所述反應的條件為室溫攪拌反應10-15h。
12、在一些實施方式中，步驟s3中所述鹽酸的濃度為1m，所述偶聯物與鹽酸的體積比為2：(0.5-2)；脫除反應在室溫下進行，時間為30±10min；所述透析為4±1℃下用生理鹽水透析3-4天，每天更換透析液2次以上。
13、根據本專利技術的再一個方面，提供了酪氨酸生物抗體，是由免疫用酪氨酸生物抗原經動物免疫制備得到，酪氨酸生物抗體為酪氨酸單克隆抗體。
14、根據本專利技術的第四個方面，提供了酪氨酸生物抗原和生物抗體在蛋白酶活力的檢測中的應用。
15、根據本專利技術的第五個方面，提供了一種酪氨酸膠體金層析檢測裝置，包括試紙條和工作液，其中試紙條從下到上依次設置樣品墊、層析膜和吸水墊；所述層析膜為硝酸纖維素膜，在層析膜靠近樣品墊的一端設置檢測線，靠近吸水墊的一端設置質控線；所述檢測線噴涂有如權利要求1所述的包被用酪氨酸生物抗原，所述質控線噴涂有羊抗鼠igg；所述工作液中包含有膠體金標記的酪氨酸生物抗體。
16、在一些實施方式中，所述膠體金標記的酪氨酸生物抗體通過如下步驟制備得到：
17、(1-1)將氯金酸溶液和檸檬酸三鈉溶液在沸騰狀態下混合，持續加熱至溶液變成酒紅色后再加熱10min后停止加熱，冷卻至室溫，得到膠體金；
18、(1-2)調節膠體金的ph值為8.0，加入酪氨酸生物抗體混勻，室溫靜置10±5min；
19、(1-3)加入牛血清蛋白混勻，靜置15±5min，離心得到沉淀；
20、(1-4)在沉淀中加入與離心前溶液等體積的復溶液復溶，即得所述膠體金標記的酪氨酸生物抗體。
21、進一步地，步驟(1-1)所述的氯金酸與檸檬酸三鈉添加的質量比為1：(1-2)；步驟(1-2)中膠體金與酪氨酸生物抗體的質量比為1：(1-10)；步驟(1-3)中膠體金與牛血清蛋白的質量比為1：(100-1000)；步驟(1-4)中所述復溶液為0.01m磷酸緩沖溶液(ph＝8.0)+1wt％bsa+5wt％蔗糖+0.1wt％nan3。
22、根據本專利技術的第六個方面，提供了一種利用上述酪氨酸膠體金層析檢測裝置測定酪氨酸含量的方法，包括如下步驟：
23、(2-1)將200μl待測溶液與40μl工作液混合均勻，在20-40℃下反應3min，得到反應溶液；
24、(2-2)將試紙條插入到步驟(2-1)所得反應溶液中，在20-40℃下反應3min后，取出試紙條，刮去試紙條下端的樣品墊，與標準溶液的顯色情況進行對比，根據檢測線深淺讀出待測溶液中酪氨酸含量，若質控線不顯色，則本次檢測無效，需重新檢測。
25、根據本專利技術的第七個方面，提供了一種蛋白酶活力的快速檢測方法，該方法具體為：
26、(3-1)稱取m克含有蛋白酶的待測樣品，用v1毫升緩沖溶液浸提，得到浸提液；
27、(3-2)取v2毫升浸提液加入v3毫升酪蛋白溶液，反應t分鐘，再加入v4毫升三氯乙酸溶液終止反應；
28、(3-3)采用酪氨酸膠體金層析檢測裝置測定其中酪氨酸的含量c；
29、(3-4)根據公式(i)計算蛋白酶活力的x，所述蛋白酶活力定義為在一定溫度和ph條件下，水解酪蛋白1min產生1μg酪氨酸所需的蛋白酶量，即為1個酶活力單位。
30、
31、其中，c為酪氨酸含量，單位為μg/ml；x為蛋白酶活力，單位為u/g；v1為浸提樣品的溶液體積，單位為ml；v為稀釋倍數，單位為ml，v＝(v2+v3+v4)/v2)；m為樣品的質量，單位為g；t為反應時間，單位為min。
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【技術保護點】
1.一種酪氨酸生物抗原，其特征在于，由N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或乳鐵蛋白；
2.一種權利要求1所述的酪氨酸生物抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟S1中，所述有機溶劑為N,N-二甲基甲酰胺；所述N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸在有機溶劑中的濃度為0.02-0.05g/mL；
4.一種酪氨酸生物抗體，其特征在于，所述酪氨酸生物抗體是由權利要求1所述的免疫用酪氨酸生物抗原經動物免疫制備得到，所述酪氨酸生物抗體為酪氨酸單克隆抗體。
5.權利要求1所述的酪氨酸生物抗原和權利要求4所述的酪氨酸生物抗體在蛋白酶活力檢測中的應用。
6.一種酪氨酸膠體金層析檢測裝置，其特征在于，所述檢測裝置包括試紙條和工作液，其中所述試紙條從下到上依次設置樣品墊、層析膜和吸水墊；所述層析膜為硝酸纖維素膜，在層析膜靠近樣品墊的一端設置檢測線，靠近吸水墊的一端設置質控線；
7.根據權利要求6所述的檢測裝置，其特征在于，所述膠體金標記的酪氨酸生物抗
8.根據權利要求7所述的檢測裝置，其特征在于，步驟(1-1)所述的氯金酸與檸檬酸三鈉添加的質量比為1：(1-2)；
9.一種利用權利要求7所述的酪氨酸膠體金層析檢測裝置測定酪氨酸含量的方法，其特征在于，包括如下步驟：
10.一種蛋白酶活力的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：
...【技術特征摘要】
1.一種酪氨酸生物抗原，其特征在于，由n-叔丁氧羰基-l-酪氨酸與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或乳鐵蛋白；
2.一種權利要求1所述的酪氨酸生物抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟s1中，所述有機溶劑為n,n-二甲基甲酰胺；所述n-叔丁氧羰基-l-酪氨酸在有機溶劑中的濃度為0.02-0.05g/ml；
4.一種酪氨酸生物抗體，其特征在于，所述酪氨酸生物抗體是由權利要求1所述的免疫用酪氨酸生物抗原經動物免疫制備得到，所述酪氨酸生物抗體為酪氨酸單克隆抗體。
5.權利要求1所述的酪氨酸生物抗原和權利要求4所述的酪氨酸生物抗體在蛋白酶活力檢測中的應...
【專利技術屬性】
技術研發人員：羅林，陳鳳燕，徐婷，張慶宇，李興周，胡鋒，雷紅濤，徐振林，張嬙，
申請(專利權)人：廣東廚邦食品有限公司，
類型：發明
國別省市：
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