【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，具體涉及一種完整腺病毒顆粒的檢測方法。
技術介紹
1、腺病毒發現60余年來，腺病毒感染全球普遍存在，時有局部暴發流行。腺病毒感染嚴重危害人類健康，快速準確的從臨床樣本和環境中檢測完整腺病毒顆粒對評價感染風險和遏制腺病毒感染至關重要。
2、腺病毒(adenovirus，ad)是一種球形、無包膜的二十面體立體對稱結構的病毒，直徑大約70-90nm，其基因組為線性、非分段的雙鏈dna，長度約25-45kb，可編碼多個蛋白質。每個基因組兩端都有倒置末端重復序列(invertedterminalre-peat，itr)。腺病毒衣殼由252個殼粒組成，其中240個為六鄰體(hexon)，12個為五鄰體(penton)。每個六鄰體是六鄰體蛋白的同源三聚體，三聚體的六鄰體分子有一個三角形的塔尖和五面體的基底。以五鄰體蛋白為基底可延伸出一纖毛(fiber)，纖毛頂端有一個膨隆為頭節區(knob)，可與細胞表面受體相結合，可在病毒感染過程中發揮重要的作用。腺病毒感染宿主細胞后，其基因組進入細胞核，進行轉錄和復制。腺病毒的生命周期分為早期和晚期兩個階段，早期基因主要涉及調控宿主細胞環境以利于病毒復制，而晚期基因則主要編碼病毒的結構蛋白。完成復制后，新合成的病毒粒子在細胞裂解或出泡方式下釋放，進而感染其他細胞。腺病毒以多種形式分泌，只含有病毒衣殼蛋白而不含核酸，或僅含有病毒dna片段，這些并不具有病毒感染活性，其中完整腺病毒顆粒是唯一具有感染性的病毒顆粒。
3、截至目前，各個領域針對腺病毒檢測方法有很多，通過
4、為此，本專利技術利用高特異性和親和性的蛋白抗體和實時定量pcr開發了一種新的免疫分子法，利用偶聯了抗體的磁珠對不同的病毒顆粒進行捕獲，然后進行dna水平的測定，來準確、快速地檢測完整腺病毒顆粒的含量，從而有利于腺病毒在腫瘤、基因治療、疫苗載體領域發揮極大的作用，為人類戰勝病魔提供了新的解決思路。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種能夠利用高特異性和高親和性的蛋白抗體與實時定量pcr，通過偶聯了抗體的磁珠對不同的病毒顆粒進行捕獲，進行dna水平的測定，來準確、快速地檢測完整腺病毒顆粒的含量的一種新的免疫分子法，已解決現有技術中檢測方法不能完整腺病毒顆粒的技術問題。
2、為了達到上述目的，本專利技術的技術方案如下：
3、本專利技術提供了一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，包括如下步驟：
4、s1、進行羧基磁珠和腺病毒抗體的偶聯，獲得羧基磁珠-抗體復合物；
5、s2、采用步驟s1獲得的羧基磁珠-抗體復合物對完整腺病毒顆粒進行腺病毒捕獲；
6、s3、分離病毒上清和磁珠；
7、s4、提取腺病毒核酸；
8、s5、利用qpcr進行腺病毒核酸檢測。
9、優選的，在步驟s1中，所述活化磁珠的制備方法為：將羧基磁珠用0.015m?ph5.5的mes緩沖液震蕩洗滌后，再加入edc/nhs偶聯劑溶液渦混勻，10-30℃反應。
10、優選的，所述edc/nhs偶聯劑與羧基磁珠的質量比為20ug/mg。
11、優選的，所述偶聯的具體操作為：活化磁珠用0.015m?ph5.5mes緩沖液洗滌后，加入用0.015m?ph5.5mes緩沖液稀釋后的pix抗體，10-30℃旋轉孵育4h以上；分離棄上清液，加入200μl磁珠封閉液10-30℃旋轉孵育1h后，分離棄上清液，保存液(pbst緩沖液)洗滌磁珠，，重懸至10g/l，得到羧基磁珠-抗體復合物，4℃保存備用；所述腺病毒抗體與羧基磁珠的質量比不少于75ug/mg。
12、優選的，在步驟s2中，所述完整腺病毒為tgf-tgfβ1或fgf2腺病毒顆粒。
13、優選的，在步驟s2中，所述所述腺病毒捕獲的方法如下：取一定量步驟s1制備的s1獲得的羧基磁珠-抗體復合物于ep管，加入5μl完整腺病毒顆粒，再加入400μlpbs緩沖液，在一定溫度下旋轉孵育。
14、優選的，所述羧基磁珠-抗體復合物的用量為10-40ul。
15、優選的，所述孵育的時間為15-60min。
16、優選的，所述孵育的溫度為4℃-25℃。
17、優選的，完整腺病毒顆粒為完整的tgf-tgfβ1和fgf2腺病毒顆粒。
18、優選的，在步驟s5中，用于檢測tgf-tgfβ1腺病毒核酸的引物對序列如下：
19、tgf-tgfβ1f：tcaggctgctgagactcaaa；
20、tgf-tgfβ1r：ctcacaacaccggtcacatc。
21、本專利技術解決技術問題的難度及意義在于：
22、現有技術針對腺病毒檢測方法雖然有很多，如免疫學方法進行病毒抗原和抗體檢測，利用定量聚合酶鏈式反應(qpcr)、環介導等溫擴增法(lamp)檢測病毒核酸等等，但是上述方法并不能真正反應病毒感染和復制能力，也就是無法檢測完成的腺病毒顆粒。因此，圍繞上述技術問題，基于腺病毒和特異性抗體反應的特點，本專利技術計了一個免疫分子平臺用于檢測完整腺病毒顆粒，該平臺的設計原理是利用抗體的氨基和羧基磁珠的羧基共價結合形成肽鍵從而將腺病毒蛋白抗體(pix抗體)與羧基磁珠相偶聯，偶聯成功的羧基磁珠-抗體復合物(mb-pix)與tgf-tgfβ1完整腺病毒(tgf-tgfβ1腺病毒)在室溫下孵育60min后，可特異性捕獲帶有pix蛋白的腺病毒顆粒，接著利用磁力架分離磁珠和上清，可以去除游離的核酸和缺乏衣殼蛋白的非完整病毒顆粒，隨后收集的腺病毒顆粒可通過實時熒光定量pcr來進行核酸檢測，排除了空病毒粒子的影響，確保本專利技術的檢測只針對完整腺病毒顆粒。
23、綜上所述，與現有技術相比，本專利技術方案具備以下有益效果：
24、對于完整病毒顆粒的檢測，傳統方法例如particle?gel?assay，需要的樣品量大，步驟繁瑣，處理時間長，而本專利技術方法可以快速準確的檢測完整病毒顆粒；且本專利技術可以基于抗原抗體特異性結合將不同病毒顆粒分開，進而準確檢測完整病毒顆粒，將有助于了解腺病毒的感染狀態、評價抗病毒療效，為臨床合理用藥提供指導。
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1.一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：包括如下步驟：
2.如權利要求1所述的一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：在步驟S1中，所述活化磁珠的制備方法為：將羧基磁珠用0.015MpH5.5的MES緩沖液震蕩洗滌后，再加入EDC/NHS偶聯劑溶液渦混勻，10-30℃反應。
3.如權利要求2所述的一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：所述EDC/NHS偶聯劑與羧基磁珠的質量比為20ug/mg。
4.如權利要求3所述的一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：所述偶聯的具體操作為：活化磁珠用0.015M?pH5.5MES緩沖液洗滌后，加入用0.015M?pH5.5MES緩沖液稀釋后的PIX抗體，10-30℃旋轉孵育4h以上；分離棄上清液，加入200μL磁珠封閉液10-30℃旋轉孵育1h后，分離棄上清液，保存液洗滌磁珠，重懸至10g/L，4℃保存備用，得到羧基磁珠-抗體復合物；所述腺病毒抗體與羧基磁珠的質量比不少于75ug/mg。
5.如權利要求2所述的一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：在步驟S2中，所述完整腺病毒為TGF-T
6.如權利要求1所述的一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：在步驟S2中，所述腺病毒捕獲的方法如下：取一定量步驟S1制備的S1獲得的羧基磁珠-抗體復合物于EP管，加入5μL完整腺病毒顆粒，再加入400μL?PBS緩沖液，在一定溫度下旋轉孵育。
7.如權利要求4所述的一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：所述羧基磁珠-抗體復合物的用量為10-40ul。
8.如權利要求4所述的一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：所述孵育的時間為15-60min。
9.如權利要求4所述的一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：所述孵育的溫度為4℃-25℃。
10.如權利要求4所述的一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：在步驟S5中，用于檢測TGF-TGFβ1腺病毒核酸的引物對序列如下：
...【技術特征摘要】
1.一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：包括如下步驟：
2.如權利要求1所述的一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：在步驟s1中，所述活化磁珠的制備方法為：將羧基磁珠用0.015mph5.5的mes緩沖液震蕩洗滌后，再加入edc/nhs偶聯劑溶液渦混勻，10-30℃反應。
3.如權利要求2所述的一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：所述edc/nhs偶聯劑與羧基磁珠的質量比為20ug/mg。
4.如權利要求3所述的一種完整腺病毒顆粒的檢測方法，其特征是：所述偶聯的具體操作為：活化磁珠用0.015m?ph5.5mes緩沖液洗滌后，加入用0.015m?ph5.5mes緩沖液稀釋后的pix抗體，10-30℃旋轉孵育4h以上；分離棄上清液，加入200μl磁珠封閉液10-30℃旋轉孵育1h后，分離棄上清液，保存液洗滌磁珠，重懸至10g/l，4℃保存備用，得到羧基磁珠-抗體復合物；所述腺病毒抗體與羧基磁珠的質量比不少于75ug/mg。
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