本發明專利技術涉及一種胞內勞森氏菌環介導等溫擴增檢測方法及其試劑盒。本發明專利技術試劑盒含有環介導等溫擴增（LAMP）反應液、BstDNA聚合酶和SYBRGreenI熒光染料顯色劑。利用試劑盒通過對樣品中DNA的提取、胞內勞森氏菌環介導等溫擴增和顯色檢測三個環節，從而檢測出胞內勞森氏菌。通過靈敏性試驗證明，本方法可對95.6pg?μL-1的DNA模板進行高效擴增，顯示出本方法高度的靈敏性。解決了現有技術中檢測步驟繁瑣、成本較高、不適于臨場檢測的問題，提供了一種使用儀器簡單、成本低、檢測快速、敏感，適于基層現場檢測胞內勞森氏菌的方法及其試劑盒。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
，涉及一種利用環介導等溫擴增(LAMP)技術進行胞內勞森氏菌快速檢測的方法，并涉及一種用于檢測胞內勞森氏菌的試劑盒。
技術介紹
胞內勞森氏菌iLawsonia intracellularis, LI)是引起豬增生性腸炎(porcine proliferative enteritis, PPE)的病原菌,該病是近年來新流行的，以回腸和結腸隱窩內未成熟的腸細胞發生腺瘤樣增生為特征的接觸性傳染病。PPE對機體吸收營養和轉化飼料能力造成根本性和持久性的破壞，是危害生長肥育豬最嚴重的細菌性疾病之一。據報道，在美國該病導致發病豬日增重平均下降37% 42%，每增重I公斤體重飼料攝入量增加27% 37%，發病豬每頭損失5 8美元。PPE已在全球豬場流行，發病率有升高 的趨勢，是目前豬場主要腸道性疾病之一。PPE的病原菌胞內勞森氏菌(LI)，具有革蘭氏陰性菌的胞壁結構和原核生物的胞漿結構，外層細胞壁由3層波紋狀膜所組成，革蘭氏染色陰性，抗酸染色陽性，能被Levaditi Silver或Warthin—Starry鍍銀染色法著色,用改良的Ziehl—Neelsen染色法細菌被染成紅色。胞內勞森氏菌微需氧，不產芽胞，基因組已測序，基因組序列全長1719350bp，編碼閱讀框(ORF)共1346個，GC含量僅33%左右。不同動物來源的胞內菌可能是相同病原。現有的胞內勞森氏菌檢測方法除了對病變腸道進行組織學檢查外，主要還有免疫熒光試驗(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和聚合酶鏈式反應(PCR)等方法，這些方法各有優勢，但也有不足，或所需時間過長、或步驟繁瑣、或成本較高。環介導等溫核酸擴增技術(LAMP)是由T. Notomi等專利技術的一種新型核酸擴增技術(Notomi,T.，et al.，Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic AcidsRes. 2000，28，e63.)，該技術依賴4條特異設計的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、高特異地擴增靶序列，方法方便、成本低，尤其適于臨場檢測，應用性強。近年來，國外已將該技術廣泛應用于病原體檢測。目前尚未見有應用環介導等溫擴增方法檢測胞內勞森氏菌的報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種采用環介導等溫擴增技術，建立檢測引起豬增生性腸炎的病原菌一胞內勞森氏菌的方法及其試劑盒，解決現有檢測步驟繁瑣、成本較高、不適于臨場檢測的問題，提供一種使用儀器簡單、成本低、檢測快速、敏感，適于基層現場檢測的方法及其試劑盒，從而為現代生豬養殖中的疾病診斷提供指導和科學依據。本專利技術所采用的技術方案是一種胞內勞森氏菌環介導等溫擴增快速檢測試劑盒，包括以下成分 (I)環介導等溫擴增(LAMP)反應液 包括0.2 μΜ的上游外引物、0.2 μΜ的下游外引物、I.6 μΜ的上游內引物、I.6 μ M的下游內引物、I M甜菜堿、6 mM硫酸鎂、1.6mM dNTP、10XThermopol反應緩沖液，其中引物序列為 上游外引物 F3 :5’ -AGCTAACGCGTTAAGCACC-3’ 下游外引物 B3 :5’ -CTTAACCCAACACCTCACGG-3’ 上游內引物 FIP :5’ -CCACGTACTCCACCGCTTGTGTACGGTCGCAAGGCTGAA-3’ 下游內引 BIP 5’-ACCCAGGCTTACATCTGAGGGAATGCAGCACCTGTCTTGAG-3’ (2)聚合酶每微升為8個活性單位的BstDNA聚合酶； (3)顯色劑SYBRGreen I熒光染料。本專利技術的另一技術方案是 一種胞內勞森氏菌環介導等溫擴增快速檢測試劑盒檢測胞內勞森氏菌的方法，包括以下步驟 (1)待檢樣品DNA的提取 提取待檢樣品胞內勞森氏菌的DNA，其中提取的樣品DNA在紫外分光光度計上檢測，其OD260/OD280應在I. 6 2. O范圍內，濃度應在10 IOOng/ μ L范圍內； (2)胞內勞森氏菌環介導等溫擴增 Α.在反應管中建立18 μ L的LAMP反應液； B.向上述反應管中加入IyL8U的Bst DNA聚合酶和Iy L胞內勞森氏菌DNA模板； C.將上述反應管置于水浴渦中65°C恒溫擴增60min ； D.將水浴溫度調到80°C放置2min從而終止反應，3 5min后取出待檢； (3)顯色檢測 在待檢的每個反應管中加入I UL的SYBR GreenI染料，室溫放置，肉眼觀察顏色變化，反應液顏色變為綠色，說明待檢樣品中含有胞內勞森氏菌，反應液顏色變為黃色，則說明待檢樣品中不含有胞內勞森氏菌。本專利技術的有點在于本專利技術是根據胞內勞森氏菌16SrRNA基因中較為保守的六個序列片段設計的兩個特異性內引物和兩個特異性外引物，該保守基因序列為胞內勞森氏菌所共有的，以保證檢測不同來源的胞內勞森氏菌的可靠性。本專利技術采用環介導等溫擴增技術，該技術特異性強，比PCR技術更為敏感，但不需要昂貴的PCR儀，只需要普通的水浴渦即可，且反應結果不需要電泳后用凝膠成像系統觀察，使用熒光染料肉眼觀察即可，簡單、快速，特別適合用于基層臨床檢測。總之，環介導等溫擴增技術，因其具有敏感、特異、快速、可靠、簡便的特點，使得它與其它診斷技術相比，更適合于臨床實驗室診斷。本專利技術建立的胞內勞森氏菌環介導等溫擴增快速檢測方法，可提高臨床診斷的速度和準確性，且操作簡單，成本低廉，適合基層使用，能有效診斷該菌引起的豬增生性腸炎病，該病得以控制后，將顯著提高生豬出欄率、降低生豬死亡率，提高生豬產業的經濟效益。具體實施例方式 下列實例進一步說明本專利技術，但不應當作為本專利技術的限制。實施例I : 胞內勞森氏菌環介導等溫擴增快速檢測試劑盒組分的配制 (I)環介導等溫擴增(LAMP)反應液在配制LAMP反應液前首先進行擴增弓I物設計根據Genbank公布的胞內勞森氏菌的基因序列，在其序列保守區域設計了 2對引物，引物序列為 上游外引物 F3 :5’ -AGCTAACGCGTTAAGCACC-3’ 下游外引物 B3 :5’ -CTTAACCCAACACCTCACGG-3’ 上游內引物 FIP :5’ -CCACGTACTCCACCGCTTGTGTACGGTCGCAAGGCTGAA-3’ 下游內引 BIP 5’-ACCCAGGCTTACATCTGAGGGAATGCAGCACCTGTCTTGAG-3’ 進而配制反應液，組分包括O. 2 μ M的上游外引物F3、0. 2 4 1的下游外引物83、1.6“] 的上游內引物？1 、1.6 μ M的下游內引物BIP、1 M甜菜堿、6 mM硫酸鎂、1.6mM dNTP、IOXThermopol反應緩沖液； (2)聚合酶每微升為8個活性單位的BstDNA聚合酶； (3)顯色劑=SYBRGreen I熒光染料。LAMP反應液最佳體系為18 μ L,成分組成如下 O. 2μΜ的上游外引物F3 O. 4μ L.O. 2 μΜ的下游外引物Β3 O. 4μ LU. 6 μ M的上游內引物FIP O. 5 μ L、l. 6 μ M的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種胞內勞森氏菌環介導等溫擴增快速檢測試劑盒，其特征在于包括以下成分：（1）環介導等溫擴增（LAMP）反應液：包括0.2？μM？的上游外引物、0.2？μM的下游外引物、1.6？μM的上游內引物、1.6？μM的下游內引物、1？M甜菜堿、6？mM硫酸鎂、1.6mM？dNTP、10×Thermopol反應緩沖液，其中引物序列為：上游外引物F3：5“？AGCTAACGCGTTAAGCACC？3“下游外引物B3：5“？CTTAACCCAACACCTCACGG？3“上游內引物FIP：5“？CCACGTACTCCACCGCTTGTGTACGGTCGCAAGGCTGAA？3“下游內引BIP：？5“？ACCCAGGCTTACATCTGAGGGAATGCAGCACCTGTCTTGAG？3“（2）聚合酶：每微升為8個活性單位的Bst？DNA聚合酶；（3）顯色劑：SYBR？Green？I？熒光染料。
【技術特征摘要】
1.一種胞內勞森氏菌環介導等溫擴增快速檢測試劑盒，其特征在于包括以下成分 (1)環介導等溫擴增(LAMP)反應液 包括0.2 μΜ的上游外引物、0.2 μΜ的下游外引物、I.6 μΜ的上游內引物、I.6 μ M的下游內引物、I M甜菜堿、6 mM硫酸鎂、1.6mM dNTP、10XThermopol反應緩沖液，其中引物序列為 上游外引物 F3 :5’ -AGCTAACGCGTTAAGCACC-3’ 下游外引物 B3 :5’ -CTTAACCCAACACCTCACGG-3’上游內引物 FIP :5’ -CCACGTACTCCACCGCTTGTGTACGGTCGCAAGGCTGAA-3’ 下游內引 BIP 5’-ACCCAGGCTTACATCTGAGGGAATGCAGCACCTGTCTTGAG-3’ (2)聚合酶每微升為8個活性單位的BstDNA聚合酶； (3)顯色劑SYBRGreen I熒光染料。2.根據權利要求I所述的一種胞內勞森氏菌環介導等溫擴增快速檢測試劑盒，其特征在于所述LAMP反應液體系為18 μ L，成分組成如下 O.2μΜ的上游外引物O. 4yL、0. 2 μ M的下游外引物O. 4 μ L、I. 6 μΜ的上游內引物O...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃翠琴，楊小燕，鄭新添，尹會方，
申請(專利權)人：龍巖學院，
類型：發明
國別省市：
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