一種檢測駝背鱸的引物對、試劑盒及檢測方法技術

本發明專利技術涉及一種檢測駝背鱸的引物對、試劑盒和檢測方法，其引物對序列如SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示。還包括含有該引物對的試劑盒及其用引物對和試劑盒的檢測方法。本發明專利技術的檢測方法簡單、快速、特異、靈敏。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，具體而言，本專利技術涉及用于檢測駝背鱸的引物對、試劑盒及其檢測方法。
技術介紹
騎背自盧iCromileptes alti又稱老鼠斑,是名貴的經濟魚類,市場需求量很大，價格特別昂貴。近年來隨著人們生活水平的提高和需求的不斷變化，名貴魚類的消費發展極為迅猛，一些不法商販頻頻通過錯誤標簽、以次充好和虛假標注等手段牟取暴利，損害消費者的利益和健康，也使得食品成分、品質和質量安全等問題逐漸凸現。為保護消費者權益，需要確定產品所用魚類的真實性和種類，建立可靠而準確的魚類物種鑒定方法。 魚類的物種鑒定，已從形態學方法發展到目前廣泛應用的分子生物學方法。形態學方法是經典的方法，但只適用于完整形態的魚樣品，一旦進行了加工，如魚片、魚糜等，那些用于鑒定的特征就可能被破壞，形態學鑒定就會變得困難，也會導致結果不準確。分子生物學方法包括蛋白質方法和DNA檢測方法。蛋白質方法的缺點是不適用于加工食品，因為高鹽、高熱、高壓等常見的加工方式會導致蛋白變性，從而使分析可靠性較低。而DNA檢測方法則更穩定耐熱，更特異，結果也更加靈敏和準確。目前在物種鑒定領域應用最廣泛的DNA檢測方法包括PCR及其相關技術(如RFLP)和DNA序列分析等。PCR是通過擴增待測樣品的DNA，使其能夠從最初的微小數量增至足以達到檢測限量的巨大數量。目前，PCR方法已廣泛應用于各個基因檢測領域。國內外學者對駝背鱸進行物種DNA鑒定的研究較少，國內外尚未見報道能夠快速、簡單、特異且靈敏地檢測駝背鱸的PCR方法以及試劑盒。因此，目前需要一種能夠快速、簡單、特異且靈敏地檢測駝背鱸的鑒定方法。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種快速、簡單、特異且靈敏地檢測駝背鱸的鑒定方法。為實現上述目的，提供一種檢測駝背鱸的引物對，具體為所述引物對序列為SEQID No 1和SEQ ID No 2所示的序列。本專利技術還提供一種試劑盒，含有SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示的序列引物對的試劑盒。本專利技術保護了所述引物對和含引物對的試劑盒用于檢測駝背鱸的用途。本專利技術提供了一種用于檢測駝背鱸的方法，其特征在于包括用所述引物對或者含所述引物對的試劑盒進行PCR擴增的步驟。具體步驟為 從樣品中提取DNA為I旲板；利用所述引物對或者含所述引物對的試劑盒中的引物對作為PCR擴增的引物，進行PCR擴增，得到擴增產物； 檢測擴增產物，并作出判斷。所述的PCR反應體系為25 μ L，即在O. 2 mL的PCR反應管中加入2. 5 μ L 10XPCR緩沖液，2. 5 μ L 25 mmol/L 的 MgCl2, 2. 5 μ L2. 5 mmol/L 的 dNTP，0.2 μ L 5 U/μ L 的DNA聚合酶，I μ L 10 4 11101/1的上游引物0&1匕1 μ L 10 μ mol/L的下游引物Calr，I μ L樣品基因組DNA，14. 3 μ L超純水。所述的PCR 反應條件為95 0C 5 min ；94 °C 30 s，60 °C 40 s，72 °C I min，共35個循環；72 V延伸7 min。所述的檢測擴增產物并作出判斷是采用電泳檢測，出現275 bp左右的特異性擴增條帶即判斷為檢出駝背鱸。本專利技術引物對是通過分析已報道的駝背鱸線粒體細胞色素氧化酶I亞基 (cytochrome oxidase subunit I，C0I)基因序列設計。本專利技術的引物對根據駝背鱸COI基因序列(Genbank序列號JF750765即SEQ IDNo 3)和其他石斑魚 COI 序列(Genbank 序列號 JF750758、JF750759、JF750760、JF750761、JF750762、JF750763、JF750764)設計得到。使用本專利技術的引物對，能夠特異、靈敏地擴增出目的片段。使用本專利技術的引物對進行檢測，實施例顯示，只有駝背鱸特異性產生275 bp的擴增條帶，其他9種石斑魚和其他30種魚均未產生275 bp的擴增條帶。駝背鱸與石斑魚屬的關系比較近，故選擇這9種石斑魚進行PCR擴增，以檢測本專利技術方法的特異性。結果表明建立的PCR方法具有良好的特異性，可用于駝背鱸的檢測。這9種石斑魚為赤點石斑魚{Epinephelus akaara )、云紋石斑魚{Epinephelus moara )、掠點石斑魚{Epinephelusfuscoguttatus)、 帶石斑魚{Epinephelus coioides)、青石斑魚{Epinephelus awoara)、瑣瑁石斑魚 QEpinephelus quoyanus )、寬額 S盧{Promicrops lanceola tus )、斑觸棘魚盧iPlec tropomus macula tus )、豹紋魚思棘魚盧 QPlec tropomus Ieopardus )。使用本專利技術的引物對進行檢測，可從駝背鱸含量為0. I %的樣品中成功檢測出駝背鱸。具有較高的靈敏度，符合日常檢測的要求。使用本專利技術的引物對進行檢測，具有靈敏度高、特異性強的特點；本專利技術的PCR檢測方法，具有高效、快速和敏感性高的優點。使用本專利技術的引物對進行檢測，其快速、特異、靈敏、準確和簡便的特點適合用于國內外市場上駝背鱸的真偽鑒別和樣品中駝背鱸成分的檢測等。附圖說明圖I為本專利技術駝背鱸PCR檢測方法的特異性試驗結果 圖2為本專利技術駝背鱸PCR檢測方法的特異性試驗結果 圖3為本專利技術駝背鱸PCR檢測方法的特異性試驗結果 圖4為是本專利技術駝背鱸PCR檢測方法的靈敏度試驗結果圖。具體實施例方式下面將結合實施例對本專利技術的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本專利技術，而不應視為限定本專利技術的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例I : I.引物對的設計根據駝背鱸COI基因序列(Genbank序列號JF750765即SEQ ID No:3)和其他石斑魚COI序列設計得到，具體引物對序列如下SEQ ID No :1 :5’ - gCTTCTCCTTgCTTCTTCTg -3，SEQ ID No :2 :5’ - gTACAgggAgAgAAAgAAgTAg -3’。弓丨物序列由TAKARA公司合成。 2.引物對的合成和試劑盒的制備 根據上述核苷酸序列信息由TAKARA公司合成引物對。將上述合成好引物對分別配制成濃度為10 Mfflol/L的溶液作為試劑盒，備用。以下實施例所述的上游引物Calf即為SEQ ID No :1，下游引物Calr即為SEQ IDNo 2 ο3.樣品基因組DNA的提取(按照QIAGEN DNeasy血液和組織DNA提取試劑盒制備樣品的基因組DNA溶液) 1)取魚的肌肉組織剪碎后，用液氮充分研磨混勻。從中取約25mg置于滅菌的I. 5 mL離心管中； 2)加入180μ ATL緩沖液和20 PL蛋白酶K，漩渦混勻，56 °C水浴約I h，并不斷搖動，直至組織完全消化； 3)加入200μ AL緩沖液，漩渦混勻。再加入200 μ 無水乙本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測駝背鱸的引物對，其特征在于，所述引物對序列為SEQ？ID？No：1和SEQ？ID？No：2所示的序列。

【技術特征摘要】
1.一種用于檢測駝背鱸的引物對，其特征在于，所述引物對序列為SEQ ID No :1和SEQID No 2所示的序列。2.一種用于檢測駝背鱸的試劑盒，其特征在于含有權利要求I所述引物對的試劑盒。3.權利要求I的引物對、權利要求2的試劑盒用于檢測駝背鱸的用途。4.一種用于檢測駝背鱸的方法，其特征在于包括用權利要求I的引物對或者權利要求2試劑盒中的引物對進行PCR擴增的步驟。5.權利要求4所述方法，其特征在于 從樣品中提取DNA為I旲板； 利用權利要求I的引物對或者權利要求2試劑盒中的引物對作為PCR擴增的引物，進行PCR擴增，得到擴增產物； 檢測擴增產物，并作出判斷。6.權利要求4或5所述方法，其特征在于所述的PCR反應體系為25μ L，即在O. 2 mL的 PCR 反應管中加入 ...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳雙雅，陳偉玲，王嘉鶴，張永祥，徐敦明，周昱，
申請(專利權)人：廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，
類型：發明
國別省市：