本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種結(jié)核肽Ag85B199–207特異性TCR、其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)成功篩選出結(jié)核肽Ag85B199–207（KLVANNTRL）特異的TCR，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將其轉(zhuǎn)染到CD8+T細(xì)胞中，獲得表達(dá)結(jié)核肽Ag85B199–207特異TCR的CD8+T細(xì)胞。該經(jīng)過(guò)TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞可成功表達(dá)外源性TCR基因，特異性識(shí)別結(jié)核肽Ag85B199–207并介導(dǎo)IFN-γ、TNF-α細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒活性，具有結(jié)核病基因治療的應(yīng)用價(jià)值，可為結(jié)核病的過(guò)繼細(xì)胞免疫治療開(kāi)辟新徑。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)核抗原肽特異性T細(xì)胞受體(TCR)，以及利用該TCR制備得到的一種用于結(jié)核基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染得到的CD8+T細(xì)胞及其在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
結(jié)核是全球范圍內(nèi)感染率最高的傳染病，病死率僅次于艾滋病。近年來(lái)，隨著人口流動(dòng)的增加、HIV與結(jié)核菌伴發(fā)感染、以及耐藥和多重耐藥菌株的流行，使全球結(jié)核病死灰復(fù)燃，呈現(xiàn)卷土重來(lái)之勢(shì)。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)報(bào)告，全世界有1/3人口受到結(jié)核菌感染，結(jié)核病患者達(dá)2000萬(wàn)，每年新發(fā)病人數(shù)800-1000萬(wàn)、因結(jié)核病死亡人數(shù)300萬(wàn)。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病人數(shù)高居全球第二，目前結(jié)核菌感染人數(shù)已超過(guò)6億，結(jié) 核病患者達(dá)600萬(wàn)之多，每年新發(fā)病人數(shù)150萬(wàn)、因結(jié)核病死亡人數(shù)25萬(wàn)，全國(guó)肺結(jié)核報(bào)告發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)一直高居各種傳染病之首。目前結(jié)核病治療仍以化療為主，但存在療程長(zhǎng)、毒副作用大等缺點(diǎn)，降低了病人服藥順從性，病人不規(guī)則服藥、自行停藥、選擇性服藥等都可能提高結(jié)核桿菌耐藥的機(jī)率，耐藥菌的產(chǎn)生是導(dǎo)致結(jié)核難治的根本原因，單一調(diào)整化療方案效果有限；而且化療無(wú)法解決因機(jī)體免疫力低下或缺陷引起的內(nèi)源性復(fù)燃和外源性再感染。因此，開(kāi)創(chuàng)新的有效的治療方法已成為當(dāng)務(wù)之急！ T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor, TCR)是所有T細(xì)胞表面的特征性標(biāo)志，在T細(xì)胞抗原識(shí)別中起關(guān)鍵作用。TCR是由α、β兩條肽鏈構(gòu)成的異二聚體，每條肽鏈又可分為可變區(qū)(V區(qū))，恒定區(qū)(C區(qū))，跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)等幾部分；其胞質(zhì)區(qū)很短，信號(hào)傳遞主要通過(guò)與其以非共價(jià)鍵結(jié)合的CD3分子進(jìn)行。TCR分子屬于免疫球蛋白超家族，其抗原特異性存在于V區(qū)；V區(qū)(Va、νβ )又各有三個(gè)高變區(qū)⑶R1XDR2、⑶R3，其中以⑶R3變異最大，直接決定了 TCR的抗原結(jié)合特異性。在TCR識(shí)別MHC-抗原肽復(fù)合體時(shí)，⑶R1、⑶R2識(shí)別和結(jié)合MHC分子抗原結(jié)合槽的側(cè)壁，而CDR3直接與抗原肽相結(jié)合。根據(jù)TCR να、νβ基因的同源性，可將80多個(gè)TCR Va基因分為32個(gè)家族、60多個(gè)TCR νβ基因分為24個(gè)家族。利用每個(gè)T細(xì)胞克隆均有其獨(dú)特CDR3序列的特點(diǎn)，采用CDR3譜型分析技術(shù)，可測(cè)定各TCR家族各CDR3出現(xiàn)的頻率，由此反映T細(xì)胞的克隆性。未接受抗原刺激的T細(xì)胞中，針對(duì)各種抗原的T細(xì)胞克隆分布均勻，表現(xiàn)為多家族和多克隆性，具體地，表現(xiàn)為各家族均出現(xiàn)呈高斯分布的約8個(gè)CDR3峰；抗原刺激則引起識(shí)別該抗原的某一個(gè)或幾個(gè)特異TCR家族T細(xì)胞反應(yīng)性增生，表現(xiàn)為該家族CDR3成員出現(xiàn)少于4個(gè)峰的寡克隆或單克隆分布，其中具有單克隆CDR3分布(表現(xiàn)為單峰)的TCR家族即是抗原特異單克隆增生的TCR家族。對(duì)該家族PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，可獲得抗原特異TCR CDR3序列。⑶8+ T細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的一種，通過(guò)抗原識(shí)別受體(TCR α β )識(shí)別多肽抗原與自體MHC I類分子形成的復(fù)合物，能特異性殺傷表達(dá)其TCR所識(shí)別的抗原表位的靶細(xì)胞，在抗細(xì)菌與病毒感染、急性同異型移植物排斥和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用中是重要的效應(yīng)細(xì)胞，被稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。近年來(lái)，在感染結(jié)核桿菌的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，功能性CD8+ T細(xì)胞的缺乏顯著增加小鼠對(duì)結(jié)核桿菌的易感性，表明CD8+ T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞一樣，在抗結(jié)核感染中具有重要的保護(hù)作用。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，⑶8+ T細(xì)胞能識(shí)別結(jié)核桿菌感染的細(xì)胞，通過(guò)釋放IFN- Y、溶解感染的靶細(xì)胞和直接殺傷細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，在抗結(jié)核桿菌感染免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。鑒定結(jié)核抗原的MHC I限制性CTL表位，對(duì)于闡明CD8+ T細(xì)胞在抗結(jié)核中的保護(hù)效應(yīng)、深入了解抗結(jié)核免疫反應(yīng)以及研發(fā)新型抗結(jié)核疫苗等具有至關(guān)重要的作用。Ag85復(fù)合體是結(jié)核桿菌表達(dá)的一種具有免疫顯性的抗原蛋白，由85A、85B和85C3種高度同源的蛋白組成，與分枝桿菌的轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)，參與合成分枝桿菌的細(xì)胞壁，能夠在多數(shù)接觸結(jié)核桿菌的健康人體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和IFN- Y釋放，是結(jié)核疫苗較理想的候選抗原。Ag85B199_2OT肽是一個(gè)高度保守的結(jié)核抗原肽，具有HLA-A*0201限制性，而此等位基因在人群中的頻率超過(guò)40%。Ag85B199_207肽可誘導(dǎo)抗結(jié)核桿菌的Thl型保護(hù)性免疫反應(yīng)，使效應(yīng)性T細(xì)胞表達(dá)IFN-Y和TNF-α等細(xì)胞因子發(fā)揮抗菌作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，以Ag85B199_207免疫HLA-A2/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠可提高T細(xì)胞增殖水平和細(xì)胞毒性水平。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于篩選出結(jié)核肽Ag85B199_2Q7 (KLVANNTRL)特異的TCR，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將其轉(zhuǎn)染到⑶8+ T細(xì)胞中，獲得表達(dá)結(jié)核肽Ag85B199_2OT特異TCR的⑶8+ T細(xì)胞，以及該經(jīng)過(guò)TCR基因修飾的CD8+ T細(xì)胞在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。 本專利技術(shù)所采用的技術(shù)方案是 結(jié)核肽Ag85B199_2Q7特異性T細(xì)胞受體(TCR)，包括a鏈和β鏈，其中，α鏈的CDR3區(qū)含有SEQ ID NO: 3所述的序列；β鏈的⑶R3區(qū)含有SEQ ID NO: 4所示的序列。優(yōu)選的，所述結(jié)核肽Ag85B199_2OT特異性TCR的a鏈?zhǔn)怯蒘EQ ID NO: 10所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性β鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β鏈?zhǔn)怯蒘EQ ID NO: 6所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性α鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述結(jié)核肽Ag85B199_2OT特異性TCR的a鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，β鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。編碼結(jié)核肽Ag85B199_2Q7特異性TCR的基因。一種結(jié)核肽Ag85B199_2OT特異性TCR的融合基因，其序列如SEQ ID NO: 13所示。一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，含有編碼結(jié)核肽Ag85B199_2(l7特異性TCR的基因。一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，含有SEQ ID NO: 13所示的基因。優(yōu)選的，上述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的出發(fā)載體為pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或 pMYx-IRES-GFP。上重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)包裝后得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒。上述逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的⑶8+ T細(xì)胞。結(jié)核肽Ag85B特異性TCR，編碼該TCR的基因，含有該基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒，該逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+ T細(xì)胞在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)方案具體步驟流程如下 I、篩選結(jié)核肽 Ag85B199_2Q7 (KLVANNTRL)特異的 TCR ①采用淋巴細(xì)胞分離液分離HLA-A*0201型健康志愿者外周血單個(gè) 核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)； ②計(jì)數(shù)PBMC，調(diào)整PBMC數(shù)目為IX IO6/孔，每孔細(xì)胞分別加入含結(jié)核肽Ag85B199_2(l7(KLVANNTRL)的 10% FBS-1640 培養(yǎng)基 2ml ； ③貼壁培養(yǎng)2h后，加入25U/mlIL-2,第3天補(bǔ)加IL-2至50U/ml，第5天本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
結(jié)核肽Ag85B199–207特異性T細(xì)胞受體（TCR），包括α鏈和β鏈，其中，α鏈的CDR3區(qū)含有SEQ？ID？NO:？3所述的序列；β鏈的CDR3區(qū)含有SEQ？ID？NO:？4所示的序列。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馬驪，郝佩佩，溫茜，羅微，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南方醫(yī)科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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